利用生物合成原理尋找微生物新藥

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1、 根 據(jù) 微 生 物 藥 物 的 生 物 合 成 原 理發(fā) 現(xiàn) 微 生 物 新 藥 的 方 法 和 途 徑n 通 過 非 基 因 定 向 改 變 、 基 因 定 向 改 變 ， 以及 組 合 生 物 催 化 的 技 術(shù) ， 或 是 改 變 原 有 微生 物 藥 物 的 生 物 合 成 途 徑 ， 或 是 對 原 有 的微 生 物 藥 物 （ 或 先 導(dǎo) 化 合 物 和 中 間 體 ） 進行 生 物 催 化 ， 以 發(fā) 現(xiàn) 微 生 物 新 藥 . 產(chǎn) 生 菌 前 體 物 質(zhì)(1) 誘 變 處 理 化 學(xué)修 飾天 然 產(chǎn) 物衍 生 物天 然 產(chǎn) 物天 然 中 間 物 天 然 產(chǎn) 物衍 生 物 阻

2、斷 或 非阻 斷 菌 株定 向 與 雜 交 生 物 轉(zhuǎn)化 與 組 合 生 物 轉(zhuǎn) 化 微 生 物 或酶 轉(zhuǎn) 化 天 然 產(chǎn) 物類 似 物 雜 合 工程 菌突 變 生 物合 成 組 合 生 物合 成(2) 基 因 操 作 天 然 產(chǎn) 物類 似 物 (1) (2)天 然 產(chǎn) 物類 似 物定 向 與 雜 交生 物 合 成化 學(xué)修 飾 微 生 物 藥 物 生 物 合 成與 微 生 物 新 藥 發(fā) 現(xiàn) 的 基 本 途 徑 n 通 過 非 基 因 定 向 改 變 的 方 法 包 括 ： 定 向 生物 合 成 、 雜 交 生 物 合 成 、 突 變 生 物 合 成 ，以 及 生 物 轉(zhuǎn) 化 與 組 合 生

3、物 轉(zhuǎn) 化 ；n 基 因 定 向 改 變 ， 即 為 組 合 生 物 合 成 。 一 、 非 遺 傳 操 作 的 定 向 生 物 合 成與 微 生 物 新 藥 的 發(fā) 現(xiàn)n 已 有 的 研 究 表 明 ， 在 抗 生 素 等 次 級 代 謝 產(chǎn) 物 生物 合 成 中 酶 底 物 的 特 異 性 足 以 使 結(jié) 構(gòu) 相 關(guān) 的代 謝 產(chǎn) 物 在 其 發(fā) 酵 液 中 積 累 ；n 但 由 于 生 物 合 成 酶 的 底 物 專 一 性 較 低 （ 寬 泛性 ） ， 其 野 生 型 菌 株 或 阻 斷 突 變 株 的 發(fā) 酵 過 程中 添 加 一 些 已 知 結(jié) 構(gòu) 類 似 物 作 為 前 體 物

4、質(zhì) ， 可以 產(chǎn) 生 含 有 與 這 種 已 知 結(jié) 構(gòu) 類 似 的 新 衍 生 物 ；n 這 種 獲 得 新 次 級 代 謝 產(chǎn) 物 的 途 徑 ， 可 以 被 稱 之為 非 遺 傳 操 作 的 定 向 生 物 合 成 (directed biosynthesis)。 前 體 （ precursor）n 即 在 微 生 物 培 養(yǎng) 過 程 中 ， 外 源 添 加 的 某 一化 學(xué) 物 質(zhì) ， 通 過 微 生 物 的 代 謝 ， 能 夠 將 其整 體 地 或 部 分 地 整 合 到 某 一 特 定 的 次 級 代謝 產(chǎn) 物 的 分 子 中 去 的 化 合 物 ， 如 苯 乙 酸 或苯 乙 酰

5、胺 及 苯 氧 乙 酸 等 ） 。 非 遺 傳 操 作 的 定 向 生 物 合 成n 這 種 在 發(fā) 酵 過 程 中 通 過 添 加 某 種 特 定 的 前 體 物 質(zhì) ，使 微 生 物 的 生 物 合 成 朝 著 將 這 些 前 體 物 質(zhì) 摻 入 到產(chǎn) 物 分 子 的 某 一 特 定 部 位 而 產(chǎn) 生 過 量 的 含 有 這 種前 體 的 產(chǎn) 物 的 方 法 ， 即 為 非 遺 傳 操 作 的 定 向 生 物合 成 。n 其 基 本 原 理 是 由 于 參 與 這 些 反 應(yīng) 的 生 物 合 成 酶 的底 物 專 一 性 較 差 ， 而 能 使 外 源 添 加 的 某 些 前 體 物質(zhì)

6、競 爭 性 地 摻 入 到 特 定 產(chǎn) 物 的 分 子 中 去 。 定 向 生 物 合 成 與 微 生 物 新 藥 的 發(fā) 現(xiàn)n 次 級 代 謝 產(chǎn) 物 合 成 酶 的 特 點 ：是 一 個 由 一 系 列 酶 參 與 催 化 的 多 酶 體 系 。參 與 催 化 反 應(yīng) 的 酶 的 底 物 專 一 性 比 初 級 代謝 合 成 酶 要 差 。 應(yīng) 用 實 例n 應(yīng) 用 非 遺 傳 操 作 定 向 生 物 合 成 的 方 法 能 夠制 備 獲 得 許 多 新 的 抗 生 素 ， 其 中 目 前 已 進行 工 業(yè) 化 生 產(chǎn) 的 有 ：n 青 霉 素 G和 V；n 培 羅 霉 素 ；n 四 環(huán)

7、素 和 金 霉 素 等 。 青 霉 素 定 向 生 物 合 成序 號 側(cè) 鏈 R 學(xué) 名 俗 名1 對 羥 基 芐 青 霉 素 青 霉 素 X2 芐 青 霉 素 青 霉 素 G 3 戊 烯 2青 霉 素 青 霉 素 F4 戊 青 霉 素 青 霉 素 二 氫 F5 庚 青 霉 素 青 霉 素 K6 丙 烯 巰 甲 基 青 霉 素 青 霉 素 O7 苯 氧 甲 基 青 霉 素 青 霉 素 V8 4 氨 基 4 羧 基丁 基 青 霉 素 青 霉 素 NNCH S CCH CH3CH3HCCNHOCR COOHO NCH S CCH CH3CH3HCCH2NO COOH青 霉 素 和 6 APA分 子

8、 結(jié) 構(gòu) 及 各 種 天 然 青 霉 素 的 結(jié) 構(gòu) 與 名 稱青 霉 素 分 子 的 化 學(xué) 結(jié) 構(gòu) 6 APA的 化 學(xué) 結(jié) 構(gòu)各 種 天 然 青 霉 素 具 有 的 側(cè) 鏈 和 名 稱HO CH 2CH 2H3C CH2 CH CH CH2H3C (CH 2)3 CH 2H 3C (CH 2)5 CH 2H2C CH CH 2 S CH 2CH 3O CH (CH 2)2 CH 2NH 2HOOC 培 羅 霉 素 定 向 生 物 合 成. 培 羅 霉 素 定 向 生 物 合 成 可 結(jié) 合 進 入 BLM的 末 端 胺 基 部 分 的 非 天 然 胺 基 化 合 物. H 2N CH2

9、CH2 NH2H2N CH2 CH NH2CH 3H2N (CH2)3 NH CH3H2N (CH2)3 N(CH3)2 H2N (CH2)3 N(CH3)2X-H2N (CH2)3 NH (CH2)3 N(CH3)2H 2N (CH2)3 N (CH2)3 NH2CH3H2N (CH2)3 NH CHCH 3 (CH2)2 NH2H2N (CH2)3 NH (CH2)3 OHH2N (CH2)3 NH (CH2)3 OCH3 H2N (CH2)3 NH 2N (CH 2)3 N H2N (CH2)3 N OH2N (CH2)2 N NH H2N (CH2)3 NH CH2*H2N (CH2)

10、3 NH CH CH3H2N CH2 CH2 NH2H 2N (CH2)3 NH* PEP的 末 端 胺 基 四 環(huán) 類 抗 生 素 的 定 向 生 物 合 成 R5 R6 R76 去 甲 基 四 環(huán) 素 H H H (1)7 氯 6 去 甲 基 四 環(huán) 素 H H Cl (2)四 環(huán) 素 H CH3 H (3)5 羥 基 四 環(huán) 素 （ 土 霉 素 ） OH CH3 H (4)7 氯 四 環(huán) 素 （ 金 霉 素 ） H CH3 Cl (5)OHR7 O OH NH2OO OHHO N(CH3)2HR6 HR5HH789 10 1166a10a 55a11a 44a12a1 2312微 生 物

11、 發(fā) 酵 產(chǎn) 生 的 一 些 四 環(huán) 素 類 抗 生 素 四 環(huán) 類 抗 生 素 的 定 向 生 物 合 成 在 生 產(chǎn) 金 霉 素 時 需 添 加 氯 化 物 作 為 前 體 ，而 當 生 產(chǎn) 四 環(huán) 素 時 ， 則 必 須 要 在 發(fā) 酵 培 養(yǎng)基 中 添 加 氯 離 子 抑 制 劑 ， 如 溴 化 物 或 M-促進 劑 等 ， 從 而 抑 制 金 霉 素 的 合 成 而 得 到 四環(huán) 素 產(chǎn) 物 。 另 外 ， 用 金 色 鏈 霉 菌 在 發(fā) 酵 的 金 霉 素 過 程中 添 加 適 量 的 甲 基 化 反 應(yīng) 抑 制 劑 如 磺 胺 嘧啶 鈉 ， 能 夠 獲 得 去 甲 基 金 霉 素

12、 。 非 基 因 改 變 定 向 生 物 合 成 的 研 究 進 展 盡 管 近 年 來 基 因 改 變 的 定 向 生 物 合 成 發(fā) 展很 快 ， 但 利 用 非 遺 傳 操 作 定 向 生 物 合 成 原理 尋 找 新 的 生 理 活 性 物 質(zhì) 的 研 究 還 在 不 少實 驗 室 繼 續(xù) 進 行 ， 特 別 是 對 一 些 肽 類 如 環(huán)孢 菌 素 A、 aureobasidins及 糖 肽 類 如 替 考拉 寧 產(chǎn) 生 菌 的 定 向 生 物 合 成 研 究 取 得 了 很大 的 進 展 。 二 、 添 加 外 源 酶 抑 制 劑 的 雜 交 生 物 合 成與 微 生 物 新 藥

13、的 發(fā) 現(xiàn)n 雜 交 生 物 合 成 （ hybrid biosynthesis） 似 乎 可 以理 解 為 是 一 種 “ 強 化 ” 的 非 遺 傳 定 向 生 物 合 成 ， 如在 苦 霉 素 產(chǎn) 生 菌 發(fā) 酵 過 程 中 添 加 聚 乙 酰 途 徑 中 -酮 酯 酰 基 合 成 酶 抑 制 劑 線 蘭 菌 素 (cerulenin)，使 其 失 去 合 成 苦 霉 素 大 環(huán) 內(nèi) 酯 苷 元 (picronolide)的 能 力 而 只 能 合 成 糖 基 。 同 時 在 發(fā) 酵 過 程 中 添 加 泰樂 菌 素 大 環(huán) 內(nèi) 酯 苷 元 (protylonolide)， 使 其 與

14、苦霉 素 生 產(chǎn) 菌 產(chǎn) 生 的 糖 基 結(jié) 合 ， 得 到 一 種 被 稱 之 為M4365G1的 雜 合 抗 生 素 (hybrid antibiotic)。 雜 交 生 物 合 成 與 微 生 物 新 藥 的 發(fā) 現(xiàn) OHO MeNHO MeMe 葡 萄 糖 1 CH3COOH6 CH3CH2COOH MeMe O O OHMeOHMe MeO Me 2 CH3COOH5 CH3CH2COHCH3CH2CH2COOHS.fradia KA 427 NO.261ProtylonolidePicronolide O MeOMeHO MeOHMe MeDesosamine O MeNHO Me

15、MeO MeOMeHO MeMe Me O O MeNHO MeMeMeMe O O OHMeOMeMeOMePicromycin D Desosaminyl Protylonolide（ M4365G1） 在 淺 藍 菌 素 存 在 下 ， 用 苦 味 霉 素 產(chǎn) 生 菌 （ S.sp.AM 4900） 與 protylonolide 雜 交 生 物 合 成 M 4365G 雜 交 生 物 合 成 產(chǎn) 物 工 業(yè) 化 的 可 能 性 盡 管 通 過 雜 交 生 物 合 成 能 夠 得 到 一 些新 的 抗 生 素 ， 但 由 于 所 添 加 的 淺 藍 菌素 本 身 就 是 一 種 昂 貴

16、的 抗 生 素 ， 再 則所 添 加 的 苷 元 的 結(jié) 構(gòu) 受 到 限 制 ， 所 以這 種 方 法 似 乎 沒 有 很 大 的 實 際 意 義 。 三 、 非 定 向 誘 變 的 突 變 生 物 合 成與 微 生 物 新 藥 的 發(fā) 現(xiàn)n 突 變 生 物 合 成 （ mutational biosynthesis） ：n 突 變 生 物 合 成 是 指 野 生 型 產(chǎn) 生 菌 經(jīng) 化 學(xué) 或 物 理 等因 素 誘 變 處 理 后 ， 喪 失 合 成 原 來 次 級 代 謝 產(chǎn) 物 的能 力 而 成 為 阻 斷 突 變 株 ， 然 后 在 發(fā) 酵 培 養(yǎng) 阻 斷 突變 株 時 添 加 某 種

17、 外 源 物 質(zhì) ， 參 與 生 物 合 成 以 獲 得新 的 次 級 代 謝 產(chǎn) 物 的 過 程 。n 另 外 ， 突 變 生 物 合 成 也 包 括 由 于 突 變 而 引 起 產(chǎn) 生新 的 次 級 代 謝 產(chǎn) 物 。 突 變 生 物 合 成 原 理阻 斷 突 變 株 的 類 型營 養(yǎng) 缺 陷 型 突 變 株 ： 由 于 編 碼 菌 體 生 長 之 必 須 的 酶 的 基 因 發(fā) 生 了 突變 ， 而 使 菌 體 不 能 生 長 ， 導(dǎo) 致 不 能 合 成 次 級 代謝 產(chǎn) 物 。 因 此 ， 這 類 突 變 株 也 可 以 稱 為 初 級 代謝 阻 斷 突 變 株 。獨 需 型 突 變

18、株 ： 這 種 突 變 株 的 生 長 和 初 級 代 謝 正 常 ， 但 由 于 編碼 次 級 代 謝 產(chǎn) 物 合 成 的 某 一 基 因 發(fā) 生 突 變 ， 而使 喪 失 了 合 成 次 級 代 謝 產(chǎn) 物 的 能 力 。 這 是 突 變生 物 合 成 所 需 要 的 突 變 株 。雙 重 阻 斷 突 變 株 ： 即 突 變 既 發(fā) 生 在 編 碼 初 級 代 謝 酶 的 基 因 上 ， 也發(fā) 生 在 編 碼 次 級 代 謝 酶 的 基 因 上 。 突 變 生 物 合 成 與 微 生 物 新 藥 發(fā) 現(xiàn). 野 生 型 產(chǎn) 生 菌 獨 需 型 突 變 株A B正 常 途 徑某 抗 生 素 阻

19、 斷 變 株 A 阻 斷 變 株 B A B+ B A+A B A BA， B為 某 一 抗 生 素 分 子 結(jié) 構(gòu) 的 兩 個 部 分A B 為 發(fā) 酵 液 培 養(yǎng) 時 阻 斷 變 株 的 代 謝 產(chǎn) 物BA 為 發(fā) 酵 培 養(yǎng) 時 添 加 的 的 結(jié) 構(gòu) 類 似 物 A B A B 即 為 新 的 雜 合 抗 生 素利 用 獨 需 型 突 變 株 合 成 產(chǎn) 生 新 抗 生 素 的 基 本 原 理A B 突 變 生 物 合 成 的基 本 流 程. 出 發(fā) 菌 株 的 選 擇誘 變 處 理阻 斷 突 變 株 篩 選瓊 脂 塊 法 選 擇有 生 理 活 力 的 突 變 株 無 生 理 活 力

20、的 突 變 株搖 瓶 復(fù) 篩 有 生 理 活 力 的 突 變 株無 生 理 活 力 的 突 變 株區(qū) 段 合 成 產(chǎn) 物 ， 連 接酶 等 生 化 特 性 的 研 究有 區(qū) 段 合 成 產(chǎn) 物 、 無連 接 酶 等 活 性 的 突 變株 有 區(qū) 段 產(chǎn) 物 A有 連 接酶 等 活 性 的 突 變 株 有 區(qū) 段 產(chǎn) 物 B有 連 接酶 等 活 性 的 突 變 株發(fā) 酵 培 養(yǎng)添 加 結(jié) 構(gòu) 類 似 物 A或 B 樣 品 收 集TLC、 H PLC檢 測 及 制 備結(jié) 構(gòu) 檢 測 突 變 生 物 合 成 產(chǎn) 生 的 新 抗 生 素.菌 種 抗 生 素 特 殊 營 養(yǎng) 增 補 物 新 抗 生 素伊

21、 尼 奧 小 單 孢 菌 西 梭 霉 素 DOS 鏈 霉 胺 等 突 變 霉 素 1等絳 紅 小 單 孢 菌 慶 大 霉 素 DOS 鏈 霉 胺 等 2 羥 基 GM等紅 霉 素 鏈 霉 菌 紅 霉 素 Erythronolide 8， 8 deoxyoleanolie 未 鑒 別弗 氏 鏈 霉 菌 新 霉 素 DOS 鏈 霉 胍 等 雜 交 霉 素 A， B加 利 利 鏈 霉 菌 阿 克 拉 霉 素 阿 克 拉 酮 紫 紅 霉 酮 等 11 羥 基 阿 克 拉 霉素 A灰 色 鏈 霉 菌 鏈 霉 素 紫 紅 霉 酮 等 2 脫 氧 鏈 霉 胍 streptomutin A卡 那 霉 素 鏈

22、霉 菌 卡 那 霉 素 DOS 1 N 甲 基 DOS等 1 N 甲 基 GM等 雪 白 鏈 霉 菌 新 生 霉 素 氨 基 香 豆 氨 基 香 豆 素 同 系 物 未 鑒 明核 糖 苷 鏈 霉 菌 核 糖 霉 素 DOS 1 N 甲 基 DOS等 1 N 甲 基 RSMC等普 拉 特 鏈 霉 菌 普 拉 特 霉 素 Platenolide Narbonolide 5 Omycaminosyl narbonolide龜 裂 鏈 霉 菌 巴 龍 霉 素 DOS 鏈 霉 胍 雜 交 霉 素 C巴 龍 鏈 霉 菌 尼 可 霉 素 尿 嘧 啶 嘧 啶 尼 可 霉 素 Z等唐 德 鏈 霉 菌 紅 霉 素

23、 生 物合 成 途 徑.丙 酰 CoA丙 酰 S ACP 甲 基 丙 二 酰 CoA甲 基 丙 二 酰 S ACP丙 酰 丙 酰 S ACP聚 酮 體 途 徑6 脫 氧 紅 霉 內(nèi) 脂 B紅 霉 內(nèi) 脂 B TDP L 碳 霉 糖 葡 萄 糖TDP D 葡 萄 糖3 O 碳 霉 糖 基 紅 霉 內(nèi) 脂 TDP 脫 氧 氨 基 己 糖 紅 霉 素 D紅 霉 素 C紅 霉 素 A紅 霉 素 E 紅 霉 素 B縮 合 酶 突 變 株 產(chǎn) 生 的新 蒽 環(huán) 類 抗 生 素. O O OR R1OH OH R2 NH2OHH3C 1234 5 6 7 89101112 123456 4 O CH OCH

24、 2CHOHCH 3 CH CH 3CH 2OH R R1 R2道 若 霉 素 （ 原 株 產(chǎn) 生 ） OCH3 COCH3 OH亞 德 里 亞 霉 素 （ 變 株 產(chǎn) 生 ） OCH3 COCH2OH OH13 雙 氫 道 若 霉 素 （ 變 株 產(chǎn) 生 ） OCH3 CHOHCH3 OH13 雙 氫 洋 紅 霉 素 OH COCH3 OH11 去 氧 道 若 霉 素 （ 變 株 產(chǎn) 生 ） OCH3 COCH2OH H11 去 氧 亞 德 里 亞 霉 素 （ 變 株 產(chǎn) 生 ） OCH3 CH2CH3 HBaumycinA*（ 原 株 產(chǎn) 生 ） OCH 3 CH2COCH3 OHFeud

25、omycin A（ 變 株 產(chǎn) 生 ） OCH3 CH2CH3 OHFeudomycin B OCH3 CH2COCH3 OH 突 變 株 產(chǎn) 生 的 一 些 新 的 次 級 代 謝 產(chǎn) 物.原 菌 種 原 抗 生 素 突 變 株 產(chǎn) 生 的 新 抗 生 素普 拉 特 鏈 霉菌 普 拉 特 霉 素 demycarosyl 普 拉 特 霉 素9 dehydromycarosyle 普 拉 特霉 素波 賽 鏈 霉 菌紫 產(chǎn) 色 鏈 霉菌 柔 紅 霉 素燼 灰 紅 菌 素 阿 霉 素燼 灰 紅 菌 素 X波 賽 鏈 霉 菌 baumycin oxaunomycin棘 孢 小 單 孢菌 慶 大 霉 素

26、 小 諾 霉 素 生 金 鏈 霉 菌 四 環(huán) 素 去 甲 基 四 環(huán) 素生 金 鏈 霉 菌 金 霉 素 去 甲 基 金 霉 素龜 裂 鏈 霉 菌 土 霉 素 去 甲 基 土 霉 素吸 水 鏈 霉 菌 carriomycin carromycinA 我 國 應(yīng) 用 突 變 生 物 合 成 原 理 找 到 的 小 諾 霉 素. O O O OHOHOH3CHN OH HO H2N NH2 H2N CH R2R1 2H2SO4 慶 大 霉 素 和 小 諾 霉 素 的 化 學(xué) 結(jié) 構(gòu)抗 生 素 R1 R2 分 子 式硫 酸 慶 大 霉 素 C1 CH3 NHCH3 C21H43N5O72H2SO4硫

27、酸 慶 大 霉 素 C1a H NH2 C19H39N5O72H2SO4硫 酸 慶 大 霉 素 C2 CH3 NH2 C20H41N5O72H2SO4小 諾 霉 素 H NHCH3 C20H41N5O72H2SO4 四 、 原 生 質(zhì) 體 融 合 與 微 生 物 新 藥 的 發(fā) 現(xiàn)n 微 生 物 原 生 質(zhì) 體 融 合 ， 即 是 指 將 雙 新 株 的 微 生 物細 胞 分 別 通 過 酶 解 脫 壁 ， 使 之 形 成 原 生 質(zhì) 體 ， 然后 在 高 滲 溶 液 的 條 件 下 混 合 ， 并 加 入 物 理 的 （ 如電 融 合 ） 或 化 學(xué) 的 (如 聚 乙 二 醇 )或 生 物

28、的 （ 如 仙臺 病 毒 ） 助 融 條 件 ， 使 雙 親 株 的 原 生 質(zhì) 發(fā) 生 相 互凝 集 ， 通 過 細 胞 質(zhì) 融 合 ， 核 融 合 ， 爾 后 發(fā) 生 基 因組 間 的 交 換 ， 重 組 ， 進 而 可 以 在 適 宜 的 條 件 下 再生 出 微 生 物 細 胞 壁 ， 獲 得 重 組 子 的 過 程 。 n 利 用 微 生 物 原 生 質(zhì) 融 合 尋 找 新 抗 生 素 的 基 本 原 理是 來 源 于 兩 種 已 知 產(chǎn) 生 不 同 抗 生 素 的 產(chǎn) 生 菌 的 融合 子 ， 有 可 能 將 它 們 的 部 分 生 物 合 成 基 因 整 合 在一 起 而 產(chǎn) 生

29、 新 的 雜 合 抗 生 素 ； 另 一 個 原 理 是 由 于抗 生 素 產(chǎn) 生 菌 中 存 在 著 沉 默 基 因 ， 當 這 些 沉 默 基因 受 到 外 源 物 質(zhì) 刺 激 后 ， 有 可 能 被 激 活 而 產(chǎn) 生 結(jié)構(gòu) 與 親 株 完 全 不 同 的 新 的 抗 生 素 。 n 應(yīng) 用 這 種 方 法 獲 得 的 第 一 個 新 抗 生 素 是 吲 哚 佐 霉素 （ indloizomycin） ： 其 親 株 為 鏈 霉 素 產(chǎn) 生 菌 灰色 霉 菌 和 天 神 霉 素 （ istamycin） 產(chǎn) 生 菌 天 神 鏈 霉菌 S. tenjimariensis。 組 合 生 物

30、合 成 組 合 生 物 合 成 的 潛 能 potentialn 重 組 、 組 合 、 互 補 、 替 換n R=可 利 用 的 基 因 n=基 因 的 等 位 形 式n 化 合 物 數(shù) Rnn R=4, n=4n Compounds=44=256 組 合 生 物 合 成 的 原 理n 生 物 合 成 酶 基 因 的 結(jié) 構(gòu) 和 組 成n 生 物 合 成 酶 基 因 的 特 異 性 及 底 物 寬 容 性n 生 物 合 成 酶 基 因 之 間 的 相 互 作 用n 生 物 合 成 途 徑 的 研 究 基 礎(chǔ) 一 、 具 有 聚 酮 體 生 物 合 成 途 徑 的微 生 物 藥 物 產(chǎn) 生 菌

31、 的 組 合 生 物 合 成 一 些 具 有 聚 酮 體 生 物 合 成 （ polyketide synthases， PKSs） 途 徑 的 “ 天 然 產(chǎn) 物 ” ， 如紅 霉 素 、 阿 維 菌 素 、 泰 樂 菌 素 、 柔 紅 霉 素 、 阿克 拉 霉 素 、 西 羅 莫 司 和 利 福 霉 素 等 可 采 用 組 合生 物 合 成 。 具 PKS途 徑 的 抗 生 素藥 物 類 別 化 合 物 大 環(huán) 內(nèi) 酯 類 抗 生 素 紅 霉 素 、 螺 旋 霉 素 、 麥 迪 霉 素四 環(huán) 類 抗 生 素 四 環(huán) 素 、 金 霉 素 、 土 霉 素抗 腫 瘤 抗 生 素 柔 紅 霉 素

32、， 阿 克 拉 霉 素 、enediynes 抗 寄 生 蟲 藥 avermectin， nemadectin 免 疫 抑 制 劑 FK506, rapamycin 抗 真 菌 藥 兩 性 霉 素 ， 制 霉 菌 素心 血 管 藥 物 lovastatin,， pactin獸 藥 莫 能 星 （ monensin） ， 泰 樂 菌 素 (tylosin)， 鹽 霉 素 1、 紅 霉 素 產(chǎn) 生 菌 的 組 合 生 物 合 成 通 過 操 作 PKS的 模 塊 中 單 個 基 因 的 組 合 生 物合 成 ； 在 非 天 然 產(chǎn) 物 產(chǎn) 生 菌 中 過 量 表 達 組 合 生 物合 成 產(chǎn) 物

33、； 通 過 操 作 PKS模 塊 之 間 連 接 的 組 合 生 物 合成 ； 通 過 操 作 脫 氧 糖 途 徑 基 因 的 組 合 生 物 合 成 。 紅 霉 素 產(chǎn) 生 菌 的 組 合 生 物 合 成 的 可 能 性n 參 與 紅 霉 素 生 物 合 成 的 PKSs， 或 6 脫 氧 紅 霉 內(nèi) 酯合 成 酶 （ 6-deoxyerythronolide B synthase，DEBS） 有 6個 模 塊 組 成 ， 每 個 模 塊 負 責 合 成 聚 酮 體中 的 一 部 分 。n 由 于 各 模 塊 之 間 的 協(xié) 調(diào) 性 ， 以 及 每 個 模 塊 延 伸 單位 的 選 擇 、

34、功 能 和 立 體 化 學(xué) 性 質(zhì) 的 催 化 結(jié) 構(gòu) 域 ，因 此 ， 就 有 可 能 通 過 對 PKSs結(jié) 構(gòu) 域 或 模 塊 的 操 作獲 得 具 有 新 穎 結(jié) 構(gòu) 的 化 合 物 。n 由 于 具 有 聚 酮 體 結(jié) 構(gòu) 的 化 合 物 其 結(jié) 構(gòu) 非 常 復(fù) 雜 和具 有 眾 多 的 立 體 異 構(gòu) 體 ， 因 而 ， 難 以 用 常 規(guī) 的 化學(xué) 方 法 來 獲 得 。 紅霉素的生物合成途徑 PKS中 的 每 一 個 模 塊 的 組 成n 酮 基 合 成 酶 （ ketosynthase， KS）n 酰 基 轉(zhuǎn) 移 酶 （ acyl transferase， AT）n 酰 基

35、載 體 蛋 白 （ acyl carrier protein， ACPn -酮 基 修 飾 酶 ： 包 括 酮 基 還 原 酶（ ketoreductase， KR） 、 脫 氫 酶（ dehydrogenase， DH） 和 烯 酰 還 原 酶（ enoylreductase， ER）n DEBS含 有 編 碼 三 個 獨 立 的 多 肽 亞 單 位 的 6個 模 塊n 大 多 數(shù) 典 型 的 聚 酮 體 合 成 途 徑 的 產(chǎn) 物 包 括 對 PKS產(chǎn)物 的 修 飾 ， 如 將 脫 氧 糖 或 氨 基 糖 進 行 糖 苷 化 以 及通 過 細 胞 色 素 P450進 行 氧 化 。 圖 中

36、 所 示 的 LD為 裝載 域 （ loading domains） ， TE為 硫 酯 酶（ esterases） 。 1） 通 過 操 作 PKS的 模 塊 中 單 個 基 因 的 組 合 生 物 合 成 一 是 用 利 福 霉素 PKS模 塊 2中的 DH/ER/KR結(jié)構(gòu) 域 取 代 紅 霉素 PKS模 塊 2中的 KR；二 是 將 模 塊 5中的 KR缺 失 ；三 是 用 利 福 霉素 模 塊 2中 的 丙二 酰 特 異 性AT取 代 模 塊 6中的 甲 基 丙 二 酰 特 異 性 的AT） ， 將 得 到一 個 發(fā) 生 三 重突 變 的 PKS產(chǎn) 物 。 2） 在 非 天 然 產(chǎn) 物

37、 產(chǎn) 生 菌 中 過 量表 達 組 合 生 物 合 成 產(chǎn) 物 n 將 E.coli 開 發(fā) 成 能 夠 表 達 PKS產(chǎn) 物 需 要 解決 的 問 題 主 要 有 三 個 方 面 ：n 一 是 能 夠 功 能 性 表 達 巨 大 的 蛋 白（ 330kDa） ；n 二 是 PKS亞 單 位 的 ACP結(jié) 構(gòu) 域 的 翻 譯 后 磷 酸泛 酰 巰 基 乙 胺 酰 化 ；n 三 是 聚 酮 體 途 徑 中 的 前 體 物 質(zhì) ， 特 別 是（ 2S） 甲 基 丙 二 酰 CoA在 E.coli中 不 存在 。 Pfeifer等 的 工 作 包 括 ：n 運 用 來 源 于 枯 草 芽 孢 桿 菌

38、 非 核 糖 體 多 肽 合 成 酶（ NRPS） 基 因 簇 的 磷 酸 泛 酰 巰 基 乙 胺 酰 轉(zhuǎn) 移 酶（ phosphopantetheinyl transferase） 基 因 sfp，以 對 PKS亞 單 位 的 ACP結(jié) 構(gòu) 域 的 翻 譯 后 磷 酸 泛 酰 巰基 乙 胺 酰 化 ；n 過 量 表 達 E.coli中 的 丙 酰 CoA合 成 酶 基 因 prpE，擾 亂 丙 酰 CoA代 謝 途 徑 ， 以 及 過 量 表 達 來 自S.coelicolar的 丙 酰 CoA羧 化 酶 基 因 pcc， 使 丙酰 CoA轉(zhuǎn) 化 為 （ 2S） 甲 基 丙 二 酰 CoA

39、3） 通 過 操 作 PKS模 塊 之 間 連 接 的 組 合 生 物 合 成 n 通 過 對 DEBS模 塊 在 E.coli和 體 外 的 表 達 研 究 ， 發(fā)現(xiàn) 在 PKS裝 配 過 程 中 那 些 短 的 模 塊 內(nèi) 和 多 肽 內(nèi) 的“ 連 接 件 ” 是 至 關(guān) 重 要 的 成 分 。 研 究 發(fā) 現(xiàn) 在 相 繼非 共 價 連 接 的 模 塊 中 ， 其 氨 基 和 羧 基 末 端 存 在 有多 肽 內(nèi) 連 接 件 ， 這 種 連 接 件 與 單 個 多 肽 內(nèi) 的 模 塊之 間 的 連 接 件 不 同 。n 因 此 ， 使 用 一 種 合 適 的 連 接 件 就 有 可 能 允

40、 許 雜 合的 模 塊 之 間 進 行 功 能 性 連 接 。 a： 已 經(jīng) 鑒 定 了 不 同 的模 塊 內(nèi) 和 多 肽 內(nèi) 的 連 接件 ， 并 由 此 指 導(dǎo) 合 成 模塊 之 間 的 聚 酮 體 中 間 體 ，這 里 需 要 合 適 的 氨 基 和羧 基 末 端 連 接 配 對 ， 以產(chǎn) 生 功 能 性 連 接 模 塊 ；b： 在 構(gòu) 建 功 能 性 互 補體 時 ， 可 以 使 用 編 碼 來源 于 不 同 微 生 物 多 個 模塊 的 全 亞 基 ；如 圖 所 示 ： 來 源 于 苦 霉素 （ picromycin） 的PKS（ PikAI和 PikAII） ，與 來 源 于 竹

41、桃 霉 素（ oleandomycin） 的 PKS（ OleA3） 相 結(jié) 合 。 4） 通 過 操 作 脫 氧 糖 途 徑 基 因 的 組 合 生 物 合 成n 對 已 經(jīng) 發(fā) 現(xiàn) 的 由 自 然 界 中 植 物 、 真 菌 和 細 菌 產(chǎn) 生的 很 多 具 有 生 理 活 性 的 糖 苷 類 化 合 物 的 分 析 發(fā) 現(xiàn) ，連 接 在 苷 元 上 的 糖 基 的 結(jié) 構(gòu) 大 多 為 6-脫 氧 己 糖（ 6-deoxyhexoses, 6DOHs） 。n 據(jù) 統(tǒng) 計 ， 這 些 具 有 生 理 活 性 的 糖 苷 類 化 合 物 的 結(jié)構(gòu) 上 含 有 70多 種 不 同 的 6-脫 氧

42、 己 糖 。 6-脫 氧 己 糖 的 種 類 具 有 生 理 活 性 的 化 合 物 產(chǎn) 生 菌 *D-Desosamine 紅 霉 素竹 桃 霉 素苦 霉 素巨 大 霉 素 Sacc.erythraeaS.antibioticusS.VenezuelaeM.megalomiceaD-Olivose 光 輝 霉 素烏 達 霉 素Landomycin S.argillaceusS.fradiaeS.cyanogenusD-Oliose 光 輝 霉 素 S.argillaceusD-Mycarose 光 輝 霉 素 S.argillaceusD-Mycaminose 泰 樂 星 S.fradiae

43、D-Mycinose 泰 樂 星 S.fradiae D-Mycosamine 制 霉 菌 素 S.nourseiL-Dihydrostreptose 鏈 霉 素 S.griseusL-Oleandrose 竹 桃 霉 素阿 弗 米 丁 S.antibioticusS.avermitillisL-Mycarose 紅 霉 素巨 大 霉 素泰 樂 星 Sacc.erythraeaM.megalomiceaS.fradiaeL-Noviose 新 生 霉 素 S.spheroidesL-Rhodinose 烏 達 霉 素LandomycinGranaticin S.fradiaeS.cyanoge

44、nusS.violaceoruberL-Daunosamine 柔 紅 霉 素 S.peucetius L-Nogalose Nogalamycin S.nogalaterL-Megosamine* 巨 大 霉 素 M.megalomiceaL-Rhodosamine 阿 克 拉 霉 素 S.galilaeusL-Epivancosamine Chloroeremomycin A.orientalis2-Deoxy-L-fucose 阿 克 拉 霉 素 S.galilaeus O O O O O O O O O O D-DeoxyhexosesCH 3 N(CH 3)2 OH OH OH oh

45、 OH OH OH OH OH OH CH 3CH 3OH CH 3 OH OMe OMe CH 3N(CH 3)2OH OH CH 3N(CH 3)2OH CH 3CH 3OHOH OH CH 3OMe OH CH 3OH OH CH 3OH NH 2 OH NH 2 OH CH 3 OH D-Forosamine D-Oliose D-Mycinose D-Mycaminose D-Desosamine D-Mycarose D-Chalcose D-Olivose D-Perosamine D-Mycosamine O O O O O O O O CH 3 OH OH OH OH OH

46、OH OH OH OH OH OH OMe CH 3OH CH 3OH NH 2 OH N(CH 3)2 CH 3 CH 3OHOH CH 3 CH 3OMeOH CH 3 CH 3CH 3OH OH OH CH 3OHOH OHCH 3OH OH OH NH 2 CH 3CH 3OH L-Deoxyhexoses L-Oleandrose L-Rhodinose L-Daunosamine L-Rnodosamine L-Mycarose L-Clacinose L-Nogaiose L-Oliose L-Noviose L-Epivancosamine 由 放 線 菌 產(chǎn) 生 的 具 有

47、不 同 生 理 活 性的 糖 苷 化 合 物 的 結(jié) 構(gòu) 特 性n 具 有 單 糖 殘 基 的 化 合 物 ： 烏 達 霉 素 A、 柔 紅 霉 素 、urdamycin A和 rebeccamycin；n 具 有 雙 糖 殘 基 的 化 合 物 ： 光 輝 霉 素（ mithramycin） ；n 具 有 三 糖 殘 基 的 化 合 物 ： 烏 達 霉 素 A（ urdamycin A）和 光 輝 霉 素 （ 前 者 同 時 具 有 單 糖 和 三 糖 殘 基 ， 后 者同 時 具 有 雙 糖 和 三 糖 殘 基 ） ；n 以 O-糖 苷 鍵 連 接 的 化 合 物 ： 紅 霉 素 A、 光

48、 輝 霉 素 、柔 紅 霉 素 和 烏 達 霉 素 A； n 以 C-糖 苷 鍵 連 接 的 化 合 物 ： 烏 達 霉 素 A；n 以 N-糖 苷 鍵 連 接 的 化 合 物 ： rebeccamycin。 O OH CH3OOH OOCH 3 OH OOH 3C NH2HO Doxorubicin O O O O O O O O O O CH3OHOHOCH3HO OOHOH H3CHOH3CHOHO H3C H 3CHOOHH3CHOH3C OH CH3 Mithramycin OHOH3CCH 3O O O O CH3H3CHO H3C OHCH3 CH3 OHO N(CH 3)2CH

49、3 O OMeCH3OHCH3Erythromycin A HN N NH O O Cl ClO OH OHOMeHO Rebeccamycin O OOH CH3OH OHO O OHCH3O OCH3HOOOH3C OOH3CHOHO Urdamycin A 由 放 線菌 產(chǎn) 生的 具 有不 同 生理 活 性的 糖 苷化 合 物的 化 學(xué)結(jié) 構(gòu) a） 通 過 將 竹 桃 霉 素 產(chǎn) 生 菌 S.antibioticus中 齊 墩 果 糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 基 因 在 不 同 的S.erythraea中 的 表 達 ， 得 到 了 3 O 鼠 李 糖 基 紅 霉 素 和 6 dEB衍 生 物

50、， 以 及一 個 desosaminylated tylactone；b） 改 造 來 源 于 刺 孢 霉 素 （ calicheamicin） 產(chǎn) 生 菌 的 基 因 ， 可 以 得 到 一 個 新 的 脫氧 氨 基 糖 ， 并 將 其 附 著 在 S.lividans產(chǎn) 生 的 苷 元 上 ； c） 在 S.lividans產(chǎn) 生 菌 中 構(gòu) 建 desosamine的 途 徑 ， 然 后 導(dǎo)入 通 過 遺 傳 操 作 的 DEBS， 可 以 得 到 具 有 新 穎 結(jié) 構(gòu) 的desosaminylated大 環(huán) 內(nèi) 酯 類 文 庫 。 (a)S. erythraea BV88 (eryB

51、V-) (+oieGll) Sugars OleGilOCH3 OHOHCH3 OH 3CO CH3OHH3C CH3H3C GTF OH3CCH3O O O O CH3CH 3OHH3C CH3 H3C OHO N(CH3)2CH3 OOH OH CH3OH 3-O-rhamnosyl-6-deoxyerythromycin B 將 竹 桃 霉 素 產(chǎn) 生 菌 抗 生 鏈霉 菌 中 編 碼 竹 桃 霉 素oleandrose糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 的 基因 oleGII， （ 該 酶 負 責 將相 應(yīng) 的 糖 基 轉(zhuǎn) 移 到 8， 8a-脫 氧 竹 桃 內(nèi) 酯 （ 8， 8a-deoxyolea

52、ndolide） 的 4位 羥 基 上 ） ， 整 合 到 紅 霉素 產(chǎn) 生 菌 eryBV缺 失 突 變 株中 ， eryBV基 因 編 碼 的 糖基 轉(zhuǎn) 移 酶 負 責 將 L-mycarose糖 基 轉(zhuǎn) 移 到 6-脫氧 紅 霉 內(nèi) 酯 （ 6-deoxyerythronolide） 甙 元的 相 同 位 置 ， 并 進 行 表 達 ，結(jié) 果 得 到 了 將 天 然 糖 基 L- rhamnose轉(zhuǎn) 移 到 6-脫 氧 紅霉 內(nèi) 酯 4 位 的 新 紅 霉 素 衍生 物 ， 其 具 有 抗 菌 活 性 ， 將 泰 樂 菌 素 產(chǎn) 生 菌 弗 氏 鏈 霉 菌 中 編碼 mycaminose

53、糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 基 因tylM2整 合 到 紅 霉 素 產(chǎn) 生 菌 三 缺 失突 變 株 SG T2， （ 分 別 缺 失 聚 酮 體合 成 酶 基 因 、 mycarose和desosamine糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 基 因 ， 但 仍然 具 有 合 成 L-mycarose和 D-desosamine的 能 力 ） ， 并 使 之 表 達 ，同 時 在 培 養(yǎng) 過 程 中 外 源 加 入 16-元環(huán) 的 泰 樂 酮 （ tylactone） ， 結(jié) 果 得到 一 種 新 的 泰 樂 星 衍 生 物 5-O-desosaminyl-tylactone， 如 圖 ） 所示 。 說 明 泰 樂

54、菌 素 產(chǎn) 生 菌 中 的 轉(zhuǎn) 移酶 TylM2能 夠 識 別 和 轉(zhuǎn) 移 不 同 的 氨基 糖 。這 兩 個 例 子 同 時 也 表 明 抗 生 素 糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 具 有 較 寬 的 底 物 專 一 性 。 (b) S. erythraea SGT2 (eryA-,eryBV-,eryClll-) (+tylM2) tryM2GTFSugars O OHOHO O CH3CH2 H3CCH 3 H3C H3C OH3CO OHO O CH3CH3H3C H3CCH 3 OHO N(CH3)2CH3 5-O-desosaminyl-tylactone 5） 通 過 表 達 雜 合 基 因

55、 方 法的 組 合 生 物 合 成 第 一 個 例 子 是 應(yīng) 用 有 些 大 環(huán) 內(nèi) 酯 類 抗 生 素 3位 或 糖基 4 位 的 羥 基 酰 化 酶 基 因 ， 使 某 些 大 環(huán) 內(nèi) 酯 類抗 生 素 在 相 應(yīng) 的 位 置 酰 化 ：1） 異 戊 酰 螺 旋 霉 素 （ 來 自 碳 霉 素 的 4” 異 戊 酰 輔 酶A轉(zhuǎn) 移 酶 的 carE基 因 ） ；2） 丙 酰 螺 旋 霉 素 （ 來 自 麥 迪 霉 素 的 4” 丙 酰 化 酶 的mpt基 因 ） ；3） 乙 酰 泰 樂 菌 素 等 （ 來 自 碳 霉 素 的 3 O 乙 酰 轉(zhuǎn) 移酶 的 acyA基 因 ） 。 引 入

56、外 源 酶 基 因 產(chǎn) 生 雜 合 抗 生 素丙 酰 螺 旋 霉 素 基 因 工 程 菌 構(gòu) 建 圖 必 特 螺 旋 霉 素 的 結(jié) 構(gòu) OO OO CHOCH 3 CH3H3CO OR1 O OHO CH3N CH3CH3 O OR 2CH3CH3OH ONH3CH3C H3C 12345 6789101112 1314 1516 17 1819 23 1 2 3 45 67 8 1 2 3 45 6 7123 4 567 8R1 H R2 COCH 2CH (CH 3)2 COCH 3 COCH 2CH 2CH 3 COCH 2CH 3 COCH 2CH 3 COCH 3 2、 蒽 環(huán) 類

57、 抗 生 素 產(chǎn) 生 菌 的 組 合 生 物 合 成 （ 略 ） 蒽 環(huán) 類 抗 生 素 是 一 類 臨 床 上 非 常 重 要 的 抗腫 瘤 抗 生 素 ， 它 們 同 樣 是 PKS生 物 合 成 途 徑 ，因 此 ， 通 過 以 下 集 中 組 合 生 物 合 成 的 方 法 ，可 以 得 到 一 系 列 “ 非 天 然 的 天 然 雜 合 化 合物 ” 。 1） 通 過 破 壞 靶 基 因 的 組 合 生 物 合 成 通 過 基 因 框 內(nèi) 的 誘 變 或 缺 失 ， 或 插 入 抗 生素 耐 藥 基 因 盒 的 方 法 ， 可 以 將 所 選 擇 的 靶基 因 特 異 性 地 鈍 化

58、 ； 盡 管 靶 基 因 的 破 壞 可 以 得 到 新 的 化 合 物 ，但 會 出 現(xiàn) 錯 誤 的 結(jié) 果 ， 這 是 因 為 一 方 面 由于 極 性 效 應(yīng) 影 響 下 游 基 因 的 表 達 ， 另 一 方面 受 到 由 于 外 源 DNA片 斷 的 插 入 造 成 的 反 義RNA合 成 影 響 上 游 基 因 。 1） 通 過 破 壞 靶 基 因 的 組 合 生 物 合 成 在 光 神 霉 素 （ mithramycin） 產(chǎn) 生 菌S.argillaceus中 ， 破 壞 編 碼 葡 萄 糖 1 磷 酸 胸 苷 5 三 磷 酸 胸 苷 轉(zhuǎn) 移 酶 的 基 因 mtmD后 ， 獲

59、得 了 兩 個 四 環(huán) 類 的 光 神 霉 素 衍 生 物 ：premithramycinone和 4 脫 甲 基premithramycinone衍 生 物 ； Premithramycinone的 抗 腫 瘤 生 物 活 性 與 光 神 霉素 相 似 ， 且 有 趣 的 是 其 化 學(xué) 結(jié) 構(gòu) 與 來 源 于 黑 曲 霉A.niger的 神 經(jīng) 肽 受 體 抑 制 劑 BMS非 常 相 似 ， 如 圖所 示 。 通 過 基 因 破 壞 后 得 到 的 兩 個 光 神 霉 素衍 生 物 和 BMS-192548 2） 通 過 表 達 雜 合 基 因 方 法的 組 合 生 物 合 成 來 源

60、于 S.fradiae的 urdE基 因 ， 編 碼 一 種 氧化 酶 ， 其 可 能 涉 及 到 將 1分 子 氧 引 入 到 烏 達霉 素 結(jié) 構(gòu) 中 ； 在 控 制 啟 動 子 ermE的 條 件 下 ， 將 其 在 丁 省霉 素 C產(chǎn) 生 菌 S.glaucescens中 表 達 ， 產(chǎn) 生一 種 新 的 雜 合 化 合 物 ， 6 羥 基 丁 省 霉 素 C，如 圖 所 示 。 通 過 將 烏 達 霉 素 產(chǎn) 生 菌 的 urdE基 因 在 丁 省 霉 素 C產(chǎn) 生 菌 中 表 達 ， 得 到 一 種 雜 合 產(chǎn) 物 6 羥 基 丁 省 霉 素 C 2） 通 過 表 達 雜 合 基

61、因 方 法 的 組 合 生 物 合 成 另 外 一 個 實 例 是 ， 將 柔 紅 霉 素 產(chǎn) 生 菌S.peucetius中 編 碼 11-aklavinone-羥 化 酶的 基 因 （ dnrF） ， 在 阿 克 拉 霉 素 產(chǎn) 生 菌S.galilaeus中 表 達 ， 結(jié) 果 得 到 了 一 種 新 的雜 合 化 合 物 ， 11 羥 基 阿 克 拉 霉 素 A， 如 圖所 示 。 這 種 羥 基 化 的 產(chǎn) 物 ， 其 對 白 血 病 細 胞 和 黑色 素 瘤 細 胞 的 生 物 活 性 比 阿 克 拉 霉 素 要 強 。 雜 合 化 合 物 11 羥 基 阿 克 拉 霉 素 A的

62、組 合 生 物 合 成 2） 通 過 表 達 雜 合 基 因 方 法 的 組 合 生 物 合 成 通 過 這 種 組 合 生 物 合 成 的 方 法 ， 已 經(jīng) 獲 得 了 數(shù)個 雜 合 糖 苷 化 的 丁 省 霉 素 ， 如 用 含 有 一 個 完 整埃 羅 霉 素 （ elloramycin） 基 因 簇 （ 具 有 產(chǎn) 生 8 去 甲 基 丁 省 霉 素 C的 能 力 ） 的 黏 粒 轉(zhuǎn) 化 烏 達 霉素 產(chǎn) 生 菌 或 光 神 霉 素 產(chǎn) 生 菌 ， 可 以 得 到 四 種 新的 糖 苷 化 合 物 ： 齊 墩 果 糖 基 、 鼠 李 糖 基 、mycarosyl丁 省 霉 素 C和

63、雙 齊 墩 果 糖 基 丁 省 霉 素 C，如 圖 所 示 。 有 趣 的 是 ， 這 些 脫 氧 糖 在 烏 達 霉 素 和 光 神 霉素 苷 元 上 的 附 著 位 置 ， 與 在 埃 羅 霉 素 的 附 著 位置 不 同 。 表 明 ， 這 些 聚 酮 體 的 糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 具 有底 物 寬 泛 性 。 雜 合 糖 苷 化 丁 省 霉 素 的 組 合 生 物 合 成 能 夠 被 ElmGT糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 轉(zhuǎn) 移 的 一 些 糖 基 和 elloramycin甙 元 的 結(jié) 構(gòu) OCH 3 OO O OHCH 3H 3COOC R 2O OH OH OR 1 R 2 R 1L-R

64、 ham nose OH 3CHO HO OH L-R hodinose OOHH 3C L-O livose OHOHOH 3C L-O leandrose OH 3CHO MeO OH 3CMeO MeO OH 3CHOHO OH 3CHOH 3C OH 3CHO OOHOHO H 3C 3,4-D im ethoxy-L-olivose D -O livose D -M ycarose D -D iolivose 表 柔 紅 霉 素 和 表 阿 霉 素 基 因 工 程 菌 的 構(gòu) 建 O OOCH 3 OH OH O H OH CH3O OH3C OHH2N Daunomycinone

65、Daunosamine 柔 紅 霉 素O O OH OHOCH 3 O OHH CH3O OHOH3C H2N 表 柔 紅 霉 素 O OOCH 3 OH OH O OHH O OH3C OH OH NH2 Adriamycinone Daunosamine 阿 霉 素 O O OHOCH 3 OH O OHH OHO OH2NHOH3C表 阿 霉 素 表 柔 紅 霉 素 和 表 阿 霉 素 基 因 工 程 菌 的 構(gòu) 建 通 過 鈍 化 dnmV基 因 ， 得 到 一 個 柔 紅 霉 素 和 阿 霉 素 產(chǎn)生 菌 的 阻 斷 突 變 株 ， dnmV基 因 編 碼 4 酮 基 還 原 酶 ，

66、其 與 合 成 這 類 抗 生 素 結(jié) 構(gòu) 中 的 脫 氧 糖 ， 柔 毛 霉 胺 的合 成 有 關(guān) 。 分 別 將 阿 維 菌 素 產(chǎn) 生 菌 中 編 碼 合 成 齊 墩 果 糖 的 基 因avrE， 以 及 紅 霉 素 產(chǎn) 生 菌 中 編 碼 合 成 mycarose的 基因 eryBIV， 克 隆 到 dnmV基 因 阻 斷 突 變 株 中 。 由 于 重 組 工 程 菌 中 的 外 源 基 因 表 達 的 4-酮 基 還 原 酶的 特 性 與 柔 紅 霉 素 產(chǎn) 生 菌 中 的 4-酮 基 還 原 酶 不 同 ，前 者 具 有 非 對 映 立 體 催 化 特 性 而 能 夠 形 成 L-epidaunosamine（ 表 柔 毛 霉 氨 ） 。 而 突 變 株 dnmV生物 合 成 甙 元 的 能 力 和 合 成 糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 的 能 力 仍 然 保持 ， 且 由 于 糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 的 底 物 專 一 性 較 差 而 不 影 響將 表 柔 毛 霉 氨 連 接 在 原 來 的 蒽 環(huán) 酮 上 ， 從 而 得 到4 -表 柔 紅 霉 素 和 4 -表 阿 霉 素 ， 如