生物固氮的15N2同位素示蹤直接測(cè)定方法

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1、生 物 固 氮 的 15N2同 位 素 示 蹤 直 接 測(cè) 定 方 法齊 孟 文中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 用 15N同 位 素 測(cè) 定 生 物 固 氮 的 方 法 可 分 為 間接 和 直 接 兩 種 方 法 ， 間 接 測(cè) 定 又 包 括 15N富 集 同 位素 示 蹤 法 和 用 15N自 然 豐 度 變 異 法 ， 該 兩 種 方 法 均需 要 參 比 作 物 或 已 知 參 比 值 以 確 定 生 物 的 固 氮 量 ，因 此 一 般 有 很 大 的 不 確 定 性 ， 固 氮 量 的 確 定 只 能是 半 定 量 的 ； 直 接 測(cè) 定 法 是 將 聯(lián) 合 固 氮 系 統(tǒng) 暴 露在 1

2、5N2氣 氛 圍 中 ， 通 過(guò) 直 接 測(cè) 定 15N吸 收 同 化 而 確定 其 固 氮 的 方 法 ， 這 種 方 法 是 一 種 定 量 測(cè) 定 生 物固 氮 的 方 法 ， 但 需 要 將 固 氮 系 統(tǒng) 封 閉 在 一 個(gè) 氣 密的 固 氮 暴 露 箱 內(nèi) ， 操 作 比 較 復(fù) 雜 ， 另 外 標(biāo) 記 同 位素 花 費(fèi) 較 高 ， 因 此 長(zhǎng) 期 以 來(lái) 在 研 究 應(yīng) 用 并 不 十 分廣 泛 ， 然 而 隨 著 DNA或 RNA探 針 技 術(shù) 的 發(fā) 展 ， 直 接固 氮 測(cè) 定 法 在 測(cè) 定 固 氮 和 確 定 固 氮 微 生 物 的 基 礎(chǔ)研 究 方 面 將 展 示 廣

3、 闊 的 應(yīng) 用 前 景 。 1.15N2的 制 備 、 純 化 和 存 儲(chǔ) 15N2可 由 15N標(biāo) 記 銨 鹽 在 堿 性 條 件 下 和 次 溴 酸 鹽 反 應(yīng)制 得 ， 即 試 劑 用 Bremner法 制 備 次 溴 酸 鹽 一 碘 溶 液 。 將 400克 NaOH溶 解 到 60毫 升 水 中 ， 將 此 NaOH溶 液 的 一 半 加 入 帶 有 溫 度計(jì) 并 以 碎 冰 冷 卻 的 一 公 升 Ernlemeyer燒 瓶 中 ， 將 120毫升 Br2緩 慢 地 、 逐 滴 地 加 入 , 猛 烈 攪 拌 , 使 溫 度 保 持 在 5 以 下 ， 再 加 入 另 一 半 N

4、aOH溶 液 ， 將 此 混 合 液 攪 拌 幾 分 鐘 ，在 冰 箱 中 貯 存 一 個(gè) 星 期 之 后 , 將 沉 淀 的 NaBr結(jié) 晶 與 上 清液 分 開(kāi) ， 用 等 體 積 的 KI溶 液 （ 0.2%， w/v） 稀 釋 上 清 液 。1 毫 升 這 種 溶 液 可 以 使 5-6毫 克 NH 3+氧 化 成 N2。 100毫 升 水 中 依 次 溶 解 5克 KMn4和 2.5克 KOH, 制 成KMNO4-KOH溶 液 ， 100毫 升 硫 酸 溶 液 （ 5%， v/v） 中 溶 解20克 NaSO4, 得 到 NaSO4 H2SO4溶 液 。 O2HBrN2OBrNH 2

5、2215-415 裝 置 制 備 裝 置 如 圖 所 示 。 各 玻 璃 部 分 間 是 通 過(guò) 涂抹 硅 油 的 磨 口 接 合 并 用 耐 壓 管 道 連 結(jié) 。 圖 中 Y和 Z分 別 為 KMnO4-KOH和 Na2SO4-H2SO4吸 存 器 ， 15N2氣 貯存 瓶 （ V） 與 另 一 只 瓶 子 （ W） 連 結(jié) , 可 以 防 止 空氣 回 流 到 V。 選 用 大 小 不 同 的 圓 底 燒 瓶 , 可 以 使 X、Y 和 Z部 分 的 容 積 , 比 試 劑 在 一 個(gè) 大 氣 壓 下 產(chǎn) 生 的15N2 的 總 體 積 稍 微 大 一 些 ， 這 時(shí) 裝 置 內(nèi) 部 的

6、 氣 壓應(yīng) 該 小 于 大 氣 壓 。 步 驟 在 燒 瓶 X中 放 入 (15NH4)2SO4， 分 液 漏 斗 中 加入 相 應(yīng) 數(shù) 量 的 次 嗅 酸 鹽 一 碘 溶 液 。 在 Y和 Z中 分 別加 入 KMnO4-KOH溶 液 和 Na2SO4-H2SO4溶 液 , 約 到 其 容積 的 1/10即 可 。 用 真 空 泵 從 處 抽 氣 , 使 X的 真 空度 達(dá) 到 大 約 10-2-10-3托 ， 關(guān) 閉 活 栓 a ， 然 后 打 開(kāi)分 液 漏 斗 的 活 栓 , 將 次 嗅 酸 鹽 一 碘 溶 液 滴 入 X中 , 產(chǎn) 生 15N2氣 ， 在 產(chǎn) 氣 過(guò) 程 結(jié) 束 后 ，

7、 將 蒸 餾 水 加 入分 液 漏 斗 , 并 使 蒸 餾 水 滴 入 燒 瓶 X中 ， 當(dāng) 瓶 中 15N2的 壓 力 稍 大 于 大 氣 壓 力 時(shí) , 滴 漏 過(guò) 程 便 自 動(dòng) 停 止 。 打 開(kāi) 活 塞 b、 c 、 d、 e 和 f, 關(guān) 閉 活 塞 g, 從 活塞 f處 對(duì) Y和 Z抽 真 空 , 關(guān) 閉 活 塞 c , 打 開(kāi) 活 塞 a , 小心 地 打 開(kāi) 活 塞 b 使 X瓶 中 15N2的 進(jìn) 入 Y,待 分 液 漏 斗中 的 水 完 全 置 換 出 X瓶 中 的 15N2 氣 體 后 , 關(guān) 閉 活 塞b。 關(guān) 閉 活 塞 e并 打 開(kāi) 活 塞 c, 從 處 放 水

8、進(jìn) 入 Y中 ， 置 換 15N2氣 體 使 其 轉(zhuǎn) 至 燒 瓶 Z , 關(guān) 緊 活 塞 d, 由 活 栓f連 通 Z和 V, 并 打 開(kāi) 活 塞 c和 g， 從 處 加 水 至 Z中 。這 樣 純 化 后 的 15N2氣 體 就 被 轉(zhuǎn) 移 至 事 先 裝 滿 水 的貯 存 瓶 V中 , 從 V 排 水 至 W瓶 , 這 種 布 置 可 阻 止 空 氣從 活 栓 h 處 回 流 15N2氣 完 全 轉(zhuǎn) 移 到 瓶 V中 之 后 , 將它 和 瓶 W一 起 , 從 活 栓 f和 g之 間 , 與 整 個(gè) 裝 置 系 統(tǒng)開(kāi) 。 圖 .制 備 15N2的 裝 置 。 X， 15N2發(fā) 生 器 ；

9、Y， KMnO4（ 5%， w/v） -KOH（ 2.5%）吸 存 器 ； Z， Na2SO4（ 20%） -H2SO4（ 5%,v/v） 吸 存 器 ； V， 15N2 存 儲(chǔ) 瓶 ； W，排 水 存 儲(chǔ) 瓶 。 1.蒸 餾 水 ， 2.次 溴 酸 鹽 -碘 溶 液 ； 3（ 15NH4） 2SO4； 4. KMnO4 - KOH溶 液 ;5. Na2SO4-H2SO4 。 2.固 氮 測(cè) 定 裝 置 和 流 程 固 氮 生 長(zhǎng) 箱 的 室 C與 A和 B通 過(guò) 涂 抹 硅 油 的 磨砂 平 邊 接 合 在 一 起 ， 在 D、 E、 F、 G和 H管 口 有 聚四 氟 乙 烯 栓 塞 閥

10、， 整 個(gè) 容 器 保 持 氣 密 狀 態(tài) 。 15N2依 次 通 過(guò) 堿 性 高 錳 酸 鉀 溶 液 和 酸 性 硫 酸 鈉 溶 液 并F口 引 入 玻 璃 容 器 。 在 15N2 引 入 前 ， 氣 密 容 器 先用 真 空 泵 抽 真 空 ， 當(dāng) 水 下 的 泥 土 中 由 于 負(fù) 壓 冒 出氣 泡 時(shí) ， 繼 續(xù) 且 保 持 幾 分 鐘 后 ， 然 后 引 入 15N2 使容 器 中 的 壓 力 達(dá) 到 大 氣 壓 。 為 了 保 持 作 物 的 生 理?xiàng)l 件 ， 使 用 空 氣 泵 通 過(guò) 二 氧 化 碳 緩 沖 溶 液 循 環(huán) 密封 室 上 端 的 （ 進(jìn) 口 D和 出 口 E）

11、 的 大 氣 相 。 緩 沖 溶液 由 混 合 物 組 成 K2CO3（ 1/20M） -KHCO3（ 1/10M） ，緩 沖 液 的 構(gòu) 成 比 例 可 以 調(diào) 節(jié) ， 以 便 頂 部 的 CO 2濃度 維 持 在 800ppm。 圖 .15N2暴 露 氣 密 性 生 長(zhǎng) 室 。 A莖 室 ； B， 中 間 室 ； C， 根 室 ； D大 氣 循 環(huán) 進(jìn) 口 ； E， 大 氣 循 環(huán) 出 口 ； F， 15N2 氣 體 入 口 ； G，氣 體 采 樣 器 附 件 ； H， 排 水 孔 。 3.同 位 素 化 學(xué) 計(jì) 量 關(guān) 系 設(shè) 樣 品 中 N來(lái) 自 大 氣 標(biāo) 記 Natm和 非 大 氣

12、 非 標(biāo) 記Nnon兩 部 分 組 成 ， 其 15N原 子 百 分 超 為 Esample， 且大 氣 標(biāo) 記 15N的 原 子 百 分 超 為 Eatomsphere， 則 由同 位 素 質(zhì) 量 平 衡 ， 有 則 ， 樣 品 中 的 N來(lái) 自 大 氣 標(biāo) 記 N的 比 例 為 atomsphereasamplenona ENENN ）（ atomsheresamplenona aatm EENN NP 固 氮 的 N量 為 在 整 個(gè) 固 氮 暴 露 過(guò) 程 中 ， 也 許 由 于 系 統(tǒng) 外 大氣 的 泄 入 或 土 壤 N2的 發(fā) 射 對(duì) 氣 相 標(biāo) 記 15N2的 稀 釋作 用 ，

13、 使 得 Eatomshere并 不 恒 定 ， 而 是 隨 時(shí) 間 減 少的 ， 因 此 計(jì) 算 時(shí) 應(yīng) 取 算 術(shù) 或 積 分 平 均 值 。atomsheresampletotala EENN 4.舉 例 參 見(jiàn) ： Atmospheric dinitrogen fixation in the flooded rice rhizosphere as determined by the N-15 isotope technique. Soil Sci. Plant Nutr., 16 (4), 551-559, 1980 表 .在 原 位 條 件 下 水 稻 根 際 大 氣 固 氮 與 固

14、 定 氮 的 植 物 吸 收樣 品 材 料 干 重 （ g） N含 量 （ %） 15N原 子 百分 超 （ %） 固 N量（ g）植 物 穗 4.01 1.160 0.007 27莖 和 葉 8.38 0.410 0.014 40根 2.86 0.412 0.045 44 土 壤 根 區(qū) 400 0.182 0.008 481 注 ： 15N2被 引 入 到 固 氮 室 上 端 的 大 氣 相 ， 在 水 稻 生 長(zhǎng) 室 持 續(xù)固 氮 7天 ， 期 間 上 端 大 大 氣 中 二 氧 化 碳 的 濃 度 始 終 維 持 在800ppm左 右 。 實(shí) 驗(yàn) 最 初 和 最 終 測(cè) 定 得 到 的 氣 相 標(biāo) 記 N2的 15N原子 百 分 超 分 別 為 為 14.1%和 10%。 計(jì) 算 ： 對(duì) 于 莖 和 葉 ， 有 參 考 文 獻(xiàn) 1 5 N2 as a tracer of biological N2 fixation: A 7 5 -year retrospective. Soil Biology & Biochemistry 1 0 6 (2 0 1 7 ) 3 6 -5 0 ）（）（ %0.2158/210.014.10.014EEP atomsheresampleatm ）（）（ gN39.920.2158%0.410%8.38PNWN atma