分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)緒論

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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),*,實(shí)驗(yàn)室規(guī)則,（一）保持實(shí)驗(yàn)室安靜，認(rèn)真仔細(xì)地按實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。,（二）穿戴好實(shí)驗(yàn)服。保持實(shí)驗(yàn)臺(tái)的清潔整齊。,（三）愛護(hù)儀器，謹(jǐn)慎使用。節(jié)約使用藥品試劑，蒸餾水，自來水和電。,（四）不得將高溫、強(qiáng)酸強(qiáng)堿、有毒污垢物品拋灑在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。,（五）公用物品用畢放回原處，不得私自占有。,（六）取完試劑應(yīng)將瓶蓋蓋好，切勿錯(cuò)蓋，用畢放回原處。,（七）加熱、用電，使用劇毒腐蝕試劑應(yīng)注意安全操作，避免事故。,（八）廢棄液體除指定有專門容器收集者外，應(yīng)倒入水池，并放水沖走，固體廢物倒入廢物缸內(nèi)。動(dòng)物尸體應(yīng)放入指定的容器中。,（

2、九）實(shí)驗(yàn)過程中自己不能解決或決定的問題，切勿盲目處理，應(yīng)及時(shí)向指導(dǎo)教師反映取得幫助。,（十）實(shí)驗(yàn)完畢，須將試劑排列整齊，整理好公用物品，將儀器洗凈收起。檫凈實(shí)驗(yàn)臺(tái)，請(qǐng)指導(dǎo)教師檢查，允許后方可離開。,成績(jī)?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn),50%實(shí)驗(yàn)+50%理論考試,實(shí)驗(yàn)課8次，實(shí)驗(yàn)報(bào)告，實(shí)驗(yàn)表現(xiàn)（包括遲到早退，著裝規(guī)范，實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范，實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生值日等），8次實(shí)驗(yàn)總分最后按比例計(jì)入總成績(jī)。,實(shí)驗(yàn)報(bào)告存檔，不需歸還學(xué)生。,理論考試內(nèi)容來自于講義及平時(shí)教學(xué),第八次設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)課安排,分組方案：4人一組（無法組隊(duì)同學(xué)加入其它組）,答辯ppt內(nèi)容：,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，意義，原理，實(shí)驗(yàn)方法選擇，預(yù)計(jì)結(jié)果及數(shù)據(jù)表現(xiàn)形式，實(shí)驗(yàn)難點(diǎn)及可能出現(xiàn)問題

3、，可能出現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差及解釋,答辯安排：,第五周將答辯ppt電子版本給老師，答辯日每組時(shí)間控制為20分鐘演講，10分鐘提問,設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)題目：,1 免疫球蛋白IgG的分離純化與鑒定。,2 人血清白蛋白的提取純化及分子量的測(cè)定。,3 蛋清中溶菌酶的分離鑒定。,4 小鼠肝臟過氧化氫酶的分離純化及酶動(dòng)力學(xué)研究。,5 如何從動(dòng)物心肌細(xì)胞中提取乳酸脫氫酶同工酶？,6 如何提取真核細(xì)胞中的線粒體基因組DNA？,7 蛋白質(zhì)的表達(dá)具有一定的組織特異性，請(qǐng)以實(shí)驗(yàn)小鼠胰腺和肝臟為材料設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)羧肽酶A1酶原(procarboxypeptidase A1)和白蛋白(Albumin)并計(jì)算這兩種蛋白質(zhì)在胰腺和肝臟中

4、的表達(dá)量。,8 細(xì)胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase）在肝臟中有三種亞型，即細(xì)胞色素氧化酶1，2和3，請(qǐng)以實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟為材料設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)這三種酶的表達(dá)并計(jì)算它們的表達(dá)量。,分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),緒論,實(shí)驗(yàn)課程改革的基本思路,教學(xué)目標(biāo)與課程安排,生物化學(xué),應(yīng)用化學(xué)的原理和方法，研究生命現(xiàn)象、生命的本質(zhì)、生命活動(dòng)及其規(guī)律的的學(xué)科。,醫(yī)學(xué)生物化學(xué),研究人體的化學(xué)組成、代謝、營養(yǎng)、酶功能、遺傳信息傳遞、生物分子的相互作用等以及疾病的分子機(jī)制。,通過研究，不僅從分子水平闡明生命現(xiàn)象及疾病分子機(jī)制，同時(shí)也可以為疾病的診斷及治療提供有效的措施。,醫(yī)學(xué)分子生物學(xué),從分子水平研究人體在正常和疾病狀態(tài)

5、下生命活動(dòng)及其規(guī)律的一門科學(xué)。,它主要研究人體生物大分子包括蛋白質(zhì)和核酸的結(jié)構(gòu)、功能、相互作用及其與疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。,分子生物學(xué)的基礎(chǔ)理論和特有的研究技術(shù)體系是分子生物學(xué)學(xué)科的重要特色，在疾病診斷及治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。,醫(yī)學(xué)遺傳學(xué),應(yīng)用遺傳學(xué)的理論與方法研究遺傳因素在疾病的發(fā)生、流行、診斷、預(yù)防、治療和遺傳咨詢等的作用機(jī)制及其規(guī)律的遺傳學(xué)分支學(xué)科。,內(nèi)容包括遺傳的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)、人類染色體與染色體病、單基因遺傳病、多基因遺傳病、生化遺傳病、線粒體基因病、腫瘤遺傳、遺傳病的診斷和產(chǎn)前診斷等以及染色體制備和基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)等。,生物化學(xué)是分子生物學(xué)的基礎(chǔ)，分子生物學(xué)是生物化學(xué)的延伸和發(fā)

6、展，遺傳學(xué)則是生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究的臨床學(xué)意義的直接體現(xiàn)，三門學(xué)科的關(guān)系可用下圖予以概括：,醫(yī)學(xué)生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)，在學(xué)科發(fā)展上及實(shí)驗(yàn)技術(shù)上互相依賴的三門課程。,分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),最大限度達(dá)到知識(shí)系統(tǒng)化、實(shí)驗(yàn)方法學(xué)習(xí)與技術(shù)訓(xùn)練的合理化。,同時(shí)為培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新精神及提高綜合素質(zhì)打下良好基礎(chǔ)。,根據(jù)本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)的目的及特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)充分考慮不同層次內(nèi)容及時(shí)間的合理安排。,目的：培養(yǎng)學(xué)生掌握最基本的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)與技能，包括提取生物大分子的方法、定量測(cè)定方法及提取效果的檢測(cè)。,包括：動(dòng)物組織中蛋白質(zhì)的提取、常用蛋白質(zhì)定量方法、蛋白質(zhì)電泳的基本方法、動(dòng)物組織DNA的提取、DNA測(cè)定

7、方法、DNA電泳的基本方法、染色體標(biāo)本制備技術(shù)、各種層析技術(shù)的原理及基本操作方法。,基本技能性實(shí)驗(yàn)及設(shè)置原則,目的：除了應(yīng)用基本技能訓(xùn)練部分的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，本類別實(shí)驗(yàn)還將學(xué)習(xí)PCR技術(shù)、蛋白印跡技術(shù)、人類外周血染色體標(biāo)本制備及核型分析等。,同時(shí)密切結(jié)合臨床問題，有針對(duì)性訓(xùn)練學(xué)生從事臨床研究的思路及掌握自行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的基本知識(shí)。,綜合性實(shí)驗(yàn)及設(shè)置原則,包括：人類外周血染色體標(biāo)本的制備及核型分析；DMD基因突變檢測(cè)；綜合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究新技術(shù)介紹,目的：現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展與多種新技術(shù)的發(fā)展與建立是密切相關(guān)的，由于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)能掌握的技術(shù)有限，因此設(shè)置了通過理論教學(xué)與視頻觀摩相結(jié)合的課程來了解蛋白質(zhì)組

8、學(xué)技術(shù)、基因芯片技術(shù)、基于序列捕獲技術(shù)的二代測(cè)序技術(shù)及它們的臨床應(yīng)用。,第一層次：掌握基本實(shí)驗(yàn)技能,蛋白質(zhì)、DNA提取方法及定量測(cè)定方法,電泳技術(shù),層析技術(shù),PCR技術(shù),染色體標(biāo)本制備技術(shù),蛋白印跡技術(shù),第二層次：了解現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究新技術(shù),蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),基因芯片技術(shù),基于序列捕獲技術(shù)的二代測(cè)序技術(shù),第三層次：學(xué)習(xí)科研設(shè)計(jì)的基本思路,通過本實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)達(dá)到目的：,實(shí)驗(yàn)操作、新技術(shù)介紹、視頻觀摩合理穿插安排，便于有效利用時(shí)間。,生物樣本中蛋白質(zhì)的提取和含量測(cè)定,SDS-PAGE,測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量,基因表達(dá)檢測(cè)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和蛋白印跡技術(shù),層析技術(shù)（凝膠過濾，離子交換，薄層層析，,HPLC,）

9、,真核生物基因組,DNA,提取、含量和純度測(cè)定,人外周血染色體標(biāo)本制備、,DMD,基因突變檢測(cè),染色體,G,分帶和核型分析及遺傳病基因突變分析,設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目,八周實(shí)驗(yàn)課的內(nèi)容安排,總體實(shí)驗(yàn)安排（8個(gè) 實(shí)驗(yàn)各有長短，個(gè)別實(shí)驗(yàn)可能會(huì),超時(shí)，但總時(shí)間大致不變）,實(shí)驗(yàn)報(bào)告,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)整理和總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及記錄，按照下列順序?qū)懗鰧?shí)驗(yàn)報(bào)告：,實(shí)驗(yàn)報(bào)告首頁：實(shí)驗(yàn)名稱（The title of experiment）；姓名；學(xué)號(hào)；班級(jí)；組別；同組同學(xué)；帶教教師；實(shí)驗(yàn)日期等。,正文：原理（Principle）；操作步驟（Operational procedure）；實(shí)驗(yàn)結(jié)果（Results）：包括照片、

10、原始數(shù)據(jù)、計(jì)算過程及圖表等；討論（Discussion）：對(duì)實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和異?，F(xiàn)象進(jìn)行探討和評(píng)論，以及對(duì)于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的認(rèn)識(shí)、體會(huì)和建議。,動(dòng)物細(xì)胞蛋白質(zhì)的提取和含量測(cè)定,蛋白質(zhì)是生命現(xiàn)象的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，是生物體最重要的組成部分。因此，對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究，是生命科學(xué)的核心問題。,要研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，往往從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)開始，而對(duì)蛋白質(zhì)含量的測(cè)定則是蛋白質(zhì)相關(guān)研究中的必備技術(shù)。,基本原理,動(dòng)物肝臟細(xì)胞比較脆弱，易于破碎，故本實(shí)驗(yàn)選用小鼠肝臟細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料。,采用勻漿法將其破碎，然后加入樣品提取液使蛋白質(zhì)溶解，用高速離心法棄去細(xì)胞碎片。收集上清液后可進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析。,蛋白質(zhì)提

11、取中最常見的問題是目的蛋白質(zhì)發(fā)生變性和被蛋白酶降解。,基本的防范措施是盡可能縮短提取時(shí)間和在盡可能低的溫度下進(jìn)行提取。,為了防止蛋白酶的破壞，可在提取液中加入蛋白酶抑制劑。,例如加入苯甲磺酰氟（PMSF）可以抑制絲氨酸蛋白酶和某些半胱氨酸蛋白酶；,胃蛋白酶抑制劑，可抑制酸性蛋白酶；,乙二胺四乙酸（EDTA）可抑制金屬蛋白酶。,為了防止蛋白質(zhì)的巰基發(fā)生氧化，可加入一定量的還原劑如巰基乙醇、二硫蘇糖醇。,考慮到溶液中如存在重金屬離子（如鋁、銅、鐵離子）可能會(huì)與蛋白質(zhì)形成不溶復(fù)合物，可在溶液中加入一定濃度的EDTA。,目前蛋白質(zhì)的含量測(cè)定常用的方法有定氮法、雙縮尿法（Biuret法）、Folin酚試

12、劑法（Lowry法）、考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）、BCA法和紫外吸收法。,其中Bradford法和Lowry法靈敏度較高，比紫外吸收法靈敏1020倍，比Biuret法靈敏100倍。,上述這些方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因?yàn)橐环N蛋白質(zhì)溶液用這幾種方法測(cè)定，有可能得出幾種不同的結(jié)果。每種測(cè)定法都不是完美無缺的，都有其優(yōu)缺點(diǎn)。,在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮：實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度；蛋白質(zhì)的性質(zhì)；溶液中存在的干擾物質(zhì)；測(cè)定所要花費(fèi)的時(shí)間。,Lowry法：,該法的原理主要是根據(jù)蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性溶液中能與銅離子結(jié)合形成復(fù)雜的絡(luò)合物（類似雙縮脲反應(yīng)）。,由于蛋白質(zhì)中酪氨酸的存在

13、，該絡(luò)合物在堿性條件下進(jìn)而與Folin酚試劑形成藍(lán)色復(fù)合物。,上述呈色反應(yīng)色澤深淺皆與蛋白質(zhì)含量成正比。因此通過比色，參照已知含量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的比色標(biāo)準(zhǔn)曲線，可確定待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)含量。,考馬斯亮蘭法：,考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。,染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在一定范圍內(nèi)，考馬斯亮蘭G250-蛋白質(zhì)復(fù)合物在595 nm下，吸光度與蛋白質(zhì)含量呈線性關(guān)系。故可以用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。,紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度：,蛋白質(zhì)中普遍含有酪氨酸與色氨酸，由于這兩種芳香

14、族氨基酸分子中含有大鍵，它們?cè)?80 nm紫外光附近有光吸收。,因而使蛋白質(zhì)在上述紫外波長附近產(chǎn)生較強(qiáng)的光吸收，利用蛋白質(zhì)的這一特性可對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定。,操作步驟,1用頸椎脫臼法處死小鼠，切開腹腔，取下完整肝臟，小心去掉膽囊（不要弄破），放入盛冷生理鹽水的燒杯中漂洗干凈。,2取小鼠肝組織0.5 g，在濾紙上剪碎，放入玻璃勻漿管中。,3按1：15的比例往玻璃勻漿管中加入勻漿緩沖液（即每份樣品需加預(yù)冷的提取緩沖液7.3mL，蛋白酶抑制劑0.2 mL），手動(dòng)勻漿。注意用力均勻，以免損壞勻漿管。,4勻漿完成后，取兩只1.5 mL eppendorf管，各加入1.2 mL勻漿液后，置入冷凍離心機(jī)中。,5

15、于4，13000 rpm離心20分鐘后，小心取出上清液至1.5 mL eppendorf管中，上清液需低溫保存，作為待測(cè)樣品備用。,Lowry法,1取16 mm*150 mm試管16支，標(biāo)明號(hào)碼，放置在試管架，在16號(hào)試管內(nèi)分別加入標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（使用時(shí)取貯液用雙蒸水稀釋至0.5 mg/mL）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，用雙蒸水補(bǔ)足至每管總體積0.5 mL，在7、8號(hào)試管內(nèi)分別加入待測(cè)樣品25、50 L，并用雙蒸水補(bǔ)足至0.5 mL（即將待測(cè)樣品稀釋20或10倍）。916號(hào)重復(fù)18號(hào)。,2各管加入2.5 mL新配制的堿性銅溶液，立即搖勻，在室溫下放置10min。,3各管

16、加入0.5 mL Folin酚試劑應(yīng)用液，邊加入邊立即充分混合（用震蕩混合器），然后在室溫下放置3060min（不要超過60min）。,4將標(biāo)準(zhǔn)樣品及待測(cè)樣品在可見光光度計(jì)上在550 nm波長下比色。,5根據(jù)已知含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得的吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待測(cè)樣品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其蛋白質(zhì)含量。根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出小鼠肝臟提取液的蛋白質(zhì)含量。,考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,1取16 mm*150 mm試管16支，標(biāo)明號(hào)碼，放置在試管架，在16號(hào)試管內(nèi)分別加入標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白（使用時(shí)取貯液用雙蒸水稀釋至0.5 mg/mL）0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL，用雙蒸水補(bǔ)足至每管總體積0.1 mL，在7、8號(hào)試管內(nèi)分別加入稀釋20、10倍的待測(cè)樣品0.1 mL。916號(hào)重復(fù)18號(hào)。,2每管加入考馬斯亮蘭G250染料試劑3 mL,搖勻，室溫靜置3分鐘。,3分光光度計(jì)于波長595nm比色。,4根據(jù)已知含量的標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得的吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待測(cè)樣品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其蛋白質(zhì)含量。根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算出小鼠肝臟提取液的蛋白質(zhì)含量。,紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,1取1