發(fā)酵工藝控制

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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,,單擊此處編輯母版文本樣式,,第二級(jí),,第三級(jí),,第四級(jí),,第五級(jí),,,*,第九章,,發(fā) 酵 工 藝 控 制,,第一節(jié),,溫度對(duì)發(fā)酵的影響及其控制,,一、 發(fā)酵熱,------,發(fā)酵過(guò)程中釋放出的凈熱量。,[ J / m,3,· h ],,,或,,,------,單位體積的發(fā)酵液在單位時(shí)間內(nèi)釋放出來(lái)的凈熱量。,,,,Q,發(fā)酵,= Q,生物,,+ Q,攪拌,,- Q,蒸發(fā),,- Q,顯,,– Q,輻射,,,1,、生物熱 （,Q,生物,）,◇,產(chǎn)生菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中本身會(huì)產(chǎn)生大量的熱，此為生物熱。,◇,,這種熱的主要來(lái)源是培養(yǎng)基中的碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)等的分解。,◇,

2、,釋放出的能量部分用來(lái)合成高能化合物,(ATP),,部分用來(lái)合成產(chǎn)物，其余的則以熱的形式散發(fā)出來(lái),,影響生物熱的因素：,,,菌株特性 培養(yǎng)基成分和濃度 發(fā)酵時(shí)期,◇,菌株對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用的速率越大，培養(yǎng)基成分越豐富，生物熱也就越大。,,◇,發(fā)酵旺盛期的生物熱大于其它時(shí)間的生物熱 （四環(huán)素,20-50,小時(shí)； 蘇云金桿菌,10-18,小時(shí)）,,2,、攪拌熱 （,Q,攪拌,）,,攪拌帶動(dòng)發(fā)酵液作機(jī)械運(yùn)動(dòng)，造成液體之間、液體和設(shè)備之間的摩擦，產(chǎn)生數(shù)量可觀的熱。,,攪拌熱與攪拌軸功率有關(guān)，可用下式計(jì)算：,,,,Q = P ×860 ×4186.8 (J / h),,,P ---,攪拌軸功率

3、，,kW,,860×4186.8 ---,機(jī)械能轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮艿臒峁Ξ?dāng)量，,J /kW.h,影響因素：,,攪拌器的類型及攪拌速度,,3,、蒸發(fā)熱 （,Q,蒸發(fā),),空氣進(jìn)入發(fā)酵罐后，就和發(fā)酵液廣泛接觸進(jìn)行熱交換，同時(shí)必然會(huì)引起水分的蒸發(fā)，蒸發(fā)所需的熱量即為蒸發(fā)熱。,4,、顯熱 （,Q,顯,）,排出氣體所帶的熱,,5,、輻射熱 （,Q,輻射,）,◇,因,罐,內(nèi)外的溫度不同，發(fā)酵液中有部分熱通過(guò)罐體向外輻射。,,,◇,輻射熱的大小決定于罐內(nèi)外的溫差,,1,）菌種特性,,2,）培養(yǎng)基 （成分及配比）,,3,）發(fā)酵階段,,4,）攪拌類型及攪拌速度,,5,）通氣速度 （影響,Q,蒸發(fā)和,Q,顯）,,6,）

4、罐內(nèi)外的溫差,影響發(fā)酵溫度的因素：,,由于,Q,生物、,Q,蒸發(fā)、,Q,顯在發(fā)酵過(guò)程中隨時(shí)間而變化，因此發(fā)酵熱在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中也隨時(shí)間變化。為了使發(fā)酵在一定溫度下進(jìn)行，必須采取措施加以控制。,,二、發(fā)酵熱的測(cè)定,方法一：,,,通過(guò)測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)冷卻水的流量和冷卻水的進(jìn)出口溫度，由下式求得這段時(shí)間內(nèi)的發(fā)酵熱：,,,,Q,發(fā)酵,= GC (t,2,- t,1,) / V (J / m,3,· h),,G ---,冷卻水流量，,kg/h,,C ---,水的,比熱，,J/kg · ℃,,t,1,、,t,2,---,進(jìn)、出口的冷卻水溫度，℃,,,V ----,發(fā)酵液體積 ，,m,3,,方法二：

5、,,,通過(guò)罐溫的自動(dòng)控制，先使罐溫達(dá)到恒定，再關(guān)閉自動(dòng)控制裝置測(cè)得溫度隨時(shí)間上升的速率,S,,按下式可求得發(fā)酵熱 ：,,,,Q,發(fā)酵,,= K · S,S ---,溫度隨時(shí)間上升的速率，,℃,/h,,K ---,總參數(shù)，代表系統(tǒng)的熱容量，,J/L·℃,,K,值可由下式,求得：,,,,K = (,MCp,),發(fā)酵液,,+ (,MCp,),容器,,+ (,MCp,),附件,M —,以每升發(fā)酵液計(jì)的發(fā)酵液、容器、附件的重量,,Cp —,代表各自的比熱,一般微生物發(fā)酵過(guò)程中的最大發(fā)酵熱約為,,,4.186× (3000,～,8000) kJ / m,3,· h,,三、溫度與發(fā)酵的關(guān)系,1

6、,、溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響,,◇,嗜,冷菌在,溫度低于,20℃,下生長(zhǎng)速率最大,,嗜中溫菌在,30-35℃,左右生長(zhǎng)速率最大,,嗜熱菌在,50℃,以上生長(zhǎng)速率最大,◇,曲線形狀相似；當(dāng)溫度增加,10℃,，生長(zhǎng)速率大致增長(zhǎng)一倍。,,,◇,當(dāng)溫度超過(guò)最適生長(zhǎng)溫度，生長(zhǎng)速率隨溫度增加而迅速下降,,,微生物產(chǎn)物的生成與微生物的生長(zhǎng)一樣受溫度的影響，但適于生長(zhǎng)和適于產(chǎn)物合成的溫度不一定相同；必須分別考察，在考慮培養(yǎng)溫度時(shí)需要采用折中的辦法。,,溫度也會(huì)影響微生物培養(yǎng)的其它重要方面，如細(xì)胞得率系數(shù)等。,當(dāng)溫度超過(guò)一定數(shù)值，細(xì)胞得率降低。主要原因是生命活動(dòng)維持方面的需求增加,,2,、溫度對(duì)發(fā)酵的影響,●,,

7、溫度對(duì)發(fā)酵的影響是各種因素綜合表現(xiàn)的結(jié)果,,從酶動(dòng)力學(xué)來(lái)看，溫度升高，反應(yīng)速率加大，代謝加快，生產(chǎn)期提前；但因酶本身很易因熱而失去活性，溫度越高，酶的失活也越快，表現(xiàn)在菌體易于衰老，發(fā)酵周期縮短，影響產(chǎn)物的最終產(chǎn)量。,1,）,溫度影響產(chǎn)物合成的速率及產(chǎn)量,●,,溫度除了直接影響發(fā)酵過(guò)程中各種反應(yīng)速率外，還通過(guò)改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)，間接影響菌的生物合成。,,2,）溫度可能會(huì)影響終產(chǎn)物的質(zhì)量,,,例如：,,蘇云金桿菌的發(fā)酵，一般在,30-31℃,進(jìn)行，這樣形成的晶體毒力強(qiáng)。若發(fā)酵溫度提高到,37℃,以上，雖然菌體生長(zhǎng)繁殖較快，最終含菌數(shù)也較高，但生物毒力較低，直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量。,3,）溫度還可能

8、影響生物合成的方向,,,例如：,,四環(huán)素發(fā)酵中金色鏈霉菌同時(shí)能產(chǎn)生金霉素。在低于,30℃,下，該菌合成金霉素能力較強(qiáng)；溫度提高，合成四環(huán)素的比例提高；在溫度達(dá)到,35℃,時(shí)，則只產(chǎn)生四環(huán)素，金霉素的合成停止,,四、最適溫度的選擇,◇,,最,適,溫度是指在該溫度下最適于菌的生長(zhǎng)或產(chǎn)物的形成。,◇,,在發(fā)酵的整個(gè)周期內(nèi)僅選一個(gè)溫度不一定好。,,因?yàn)樽钸m合菌生長(zhǎng)的溫度不一定適合產(chǎn)物的合成。,,例如：,,,青霉素產(chǎn)生菌的最適生長(zhǎng)溫度是,30℃,，而最適于青霉素合成的溫度是,20℃,。,,,發(fā)酵過(guò)程中，在生長(zhǎng)初期抗生素還未開始合成，菌絲還未長(zhǎng)濃，這時(shí)的溫度應(yīng)適于微生物的生長(zhǎng)；到抗生素分泌期，菌絲已長(zhǎng)到一

9、定濃度，積累抗生素是重點(diǎn)考慮，此時(shí)應(yīng)滿足生物合成的最適溫度。,,溫度的選擇還要參考其它發(fā)酵條件靈活掌握,,●,,通氣條件,,,在通氣條件差的情況下，最適的發(fā)酵溫度應(yīng)比在正常良好通氣條件下低一些；這是由于在較低的溫度下，氧溶解度相應(yīng)大些，菌的生長(zhǎng)速率相應(yīng)小些，從而彌補(bǔ)可能因通氣不足而造成的代謝異常。,,●,,培養(yǎng)基成分和濃度,,,在使用較稀薄或較易利用的培養(yǎng)基時(shí)，提高培養(yǎng)溫度則養(yǎng)料往往過(guò)早耗竭，導(dǎo)致菌絲過(guò)早自溶，使抗生素產(chǎn)量降低。,,利用計(jì)算機(jī)模擬確定最佳發(fā)酵條件，正逐步得到推廣應(yīng)用。,,,●,根據(jù)模擬計(jì)算機(jī)對(duì)發(fā)酵溫度最佳點(diǎn)的計(jì)算，得到青霉素發(fā)酵的最適溫度是：,,起初,5h,維持在,30℃,；,

10、隨后降到,25℃,，,培養(yǎng),35h,；,再降到,20℃,培養(yǎng),85h,；,最后回升到,25℃,培養(yǎng),40h,放,罐。,,●,,采用這種變溫培養(yǎng)，比在,25℃,恒溫培養(yǎng)青霉素產(chǎn)量提高,15%,。,,五、溫度的控制,方法：,,,罐壁調(diào)溫,,夾層調(diào)溫,,罐內(nèi)調(diào)溫,,,,第二節(jié),,pH,對(duì)發(fā)酵的影響及其控制,,一、,pH,對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的影響,1,）,pH,影響酶的活性,,,,當(dāng),pH,抑制菌體中某些酶的活性時(shí)，使菌體的新陳代謝受阻,2,）,pH,影響微生物細(xì)胞膜所帶電荷的狀態(tài)，從而改變細(xì)胞膜的滲透性，影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的排泄，因此影響代謝的正常進(jìn)行。,,4,）,pH,不同，往

11、往引起菌體代謝過(guò)程的不同，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。,3,）影響培養(yǎng)基某些組分和中間產(chǎn)物的離解，從而影響微生物對(duì)這些物質(zhì)的利用。,●,例如：黑曲霉在,pH2-3,時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸，在,pH,接近中性時(shí)，則產(chǎn)生草酸。,,●,又如：丙酮丁醇發(fā)酵中，發(fā)酵后期,pH,為,4.3-5.3,時(shí)積累丙酮丁醇，,pH,升高則丙酮丁醇產(chǎn)量減少，而丁酸、乙酸含量增加。,,二、發(fā)酵過(guò)程中,pH,的變化及影響,pH,變化的因素,1,、發(fā)酵過(guò)程中,pH,的變化,1,）生長(zhǎng)階段,,,,,pH,有,上升或下降趨勢(shì)（相對(duì)于接種后起始,pH,而言）,,,如：,利福霉素,B,發(fā)酵起始,pH,為,中性，但生長(zhǎng)初期由于菌體產(chǎn)

12、生的蛋白酶水解蛋白胨而生成銨離子，使,pH,上升至堿性；接著，隨著銨離子的利用及葡萄糖利用過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸使,pH,下降到酸性范圍。,,2,）生產(chǎn)階段,,在生產(chǎn)階段，,pH,趨于穩(wěn)定，維持在最適,,產(chǎn)物合成的范圍,3,）自溶階段,,,,菌絲自溶階段，隨著基質(zhì)的耗盡，菌體蛋白酶的活,,躍，培養(yǎng)液中氨基氮增加，致使,pH,上升，此時(shí)菌,,絲趨于自溶而代謝活動(dòng)終止。,,2,、引起發(fā)酵液中,pH,變化的因素,◇,發(fā)酵過(guò)程中,pH,的,變化取決于微生物的種類、培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵條件。,,,◇,在菌體代謝過(guò)程中，菌體本身有建成其生長(zhǎng)最適,pH,的,能力，但外界條件發(fā)生較大變化時(shí)，,pH,將會(huì)不斷波動(dòng)。,

13、,引起,pH,下降的因素：,,,（凡是導(dǎo)致酸性物質(zhì)生成或釋放及堿性物質(zhì)消耗的發(fā)酵，其,pH,都會(huì)下降）,1,）培養(yǎng)基中碳氮比例不當(dāng)，碳源過(guò)多，特別是葡萄糖過(guò)量，或者中間補(bǔ)糖過(guò)多加之溶解氧不足，致使有機(jī)酸大量積累而,pH,下降。,2,）消泡油加得過(guò)多,3,）生理酸性物質(zhì)的存在，氨被利用，,pH,下降,,引起,pH,上升的因素：,,,（凡是導(dǎo)致堿性物質(zhì)生成或釋放及酸性物質(zhì)消耗的發(fā)酵，其,pH,都會(huì)下降）,1,）培養(yǎng)基中碳氮比例不當(dāng)，氮源過(guò)多，氨基氮釋放，使,pH,上升。,2,）生理堿性物質(zhì)存在,3,）中間補(bǔ)料中氨水或尿素等堿性物質(zhì)的加入過(guò)多使,pH,上升。,,三、最適,pH,的選擇,1,、微生物生

14、長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的最適,pH,,●,大多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)的最適,pH6.3,～,7.5,,●,霉菌最適生長(zhǎng),pH3,～,6,●,放線菌生長(zhǎng)最適,,,pH7,～,8,,,,,微生物生長(zhǎng)階段和產(chǎn)物合成階段的最適,pH,往往不同，這不僅與菌種特性有關(guān)，也取決于產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)。,例如：,,一般產(chǎn)生堿性抗生素的，如灰色鏈霉菌生產(chǎn)鏈霉素、紅色鏈霉菌產(chǎn)生紅霉素，其合成產(chǎn)物的最適,pH,為,6.8-7.3,，中性偏堿；而產(chǎn)生兩性抗生素的，如金色鏈霉菌生產(chǎn)金霉素，其合成產(chǎn)物的最適,pH,為,5.9-6.3,,弱酸性。,,2,、最適,pH,的選擇,◇,,,選擇合適,pH,值的準(zhǔn)則是有利于菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成，以獲得較高的產(chǎn)

15、量,◇,,生長(zhǎng)期和生產(chǎn)期的,pH,不一定相同,,例如利福霉素,B,發(fā)酵的最佳,pH,方案,是：生長(zhǎng)期,pH,保持在,6.5,，生產(chǎn)期,pH,為,7.0,。,,四、,pH,的控制,1,、在基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方中考慮到維持,pH,的需要,,,例如加入,CaCO,3,，,使用緩沖液等,2,、通過(guò)補(bǔ)加酸、堿來(lái)調(diào)節(jié)控制,3,、通過(guò)中間補(bǔ)料來(lái)控制,,,例如可以根據(jù)生產(chǎn)菌的代謝需要用改變加糖速率來(lái)控制,pH,,也可通過(guò)中間補(bǔ)加尿素或硫酸銨等調(diào)節(jié),,第三節(jié),,基質(zhì)濃度對(duì)發(fā)酵的影響及其控制,,一、基質(zhì)濃度對(duì)發(fā)酵的影響,1,、,,對(duì)生長(zhǎng)的影響,,可用,Monod,方程來(lái)描述基質(zhì)濃度與生長(zhǎng)速率的關(guān)系,,? = ?,max

16、,S,,Ks + S,?,---,比生長(zhǎng)速率,,?,max,---,最大比生長(zhǎng)速率,,S ---,基質(zhì)濃度,,K,s,---,飽和常數(shù),,（?,= 0.5?,max,時(shí)的基質(zhì)濃度）,,●,,S,＞＞,Ks,，,?,趨向于?,max,,,●,,然而，由于代謝產(chǎn)物或基質(zhì)濃度過(guò)濃可能會(huì)導(dǎo),,致抑制作用，出現(xiàn)比生長(zhǎng)速率下降,,,●,當(dāng)濃度超過(guò)某值，還可能導(dǎo)致細(xì)胞脫水,,2,、 對(duì)產(chǎn)物形成的影響,●,基,質(zhì),濃度對(duì)產(chǎn)物形成的影響類似于生長(zhǎng),,●,在一定范圍內(nèi)，基質(zhì)濃度大，通常產(chǎn)物產(chǎn)量高,,●,過(guò)濃，使菌體生長(zhǎng)過(guò)于旺盛，發(fā)酵液非常粘稠，,,傳質(zhì)狀況差，對(duì)產(chǎn)物的合成不利,例如：,,,以乙醇為碳源發(fā)酵谷氨

17、酸，當(dāng)乙醇濃度達(dá),35g/L,，,可延長(zhǎng)谷氨酸生產(chǎn)時(shí)間，提高產(chǎn)量；但在更高濃度下，菌體生長(zhǎng)受到抑制，產(chǎn)量降低,,二、 基,質(zhì),濃度的控制,——,補(bǔ)料控制,,為解除基質(zhì)過(guò)濃的抑制、產(chǎn)物的反饋抑制和葡萄糖效應(yīng)，以及避免在分批發(fā)酵中因一次性投糖（料）過(guò)多造成細(xì)胞大量生長(zhǎng)，耗氧過(guò)多而供氧不足的狀況，通常采用中間補(bǔ)料工藝。,,補(bǔ)料的,方式：,,,,1,）于預(yù)定時(shí)間一次性補(bǔ)料或間歇補(bǔ)料,,,2,）連續(xù)恒速補(bǔ)料,,,3,）變速補(bǔ)料（指數(shù)流加,）,,,為有效地進(jìn)行中間補(bǔ)料，須選擇恰當(dāng)?shù)姆答伩刂茀?shù)；掌握這些參數(shù)與微生物生長(zhǎng)、基質(zhì)利用和產(chǎn)物形成之間的關(guān)系。,,反饋控制操作分,直接法,和,間接法,1,）直接法：,

18、◇,,直接以限制性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度作為反饋控制參數(shù),,,例如碳源、氮源、碳氮比,◇,,由于缺乏直接測(cè)量重要參數(shù)的傳感器，該法的使用受到,,一定限制。,,,目前只有少數(shù)基質(zhì)，如甲醇、乙醇、葡萄糖等可直接測(cè)量,,2,）間接法,,,,以溶氧、呼吸商、代謝物濃度等作為反饋控制參數(shù),,第四節(jié),,溶氧濃度對(duì)發(fā)酵的影響及控制,,一、溶氧測(cè)定的意義,1,、溶氧作為發(fā)酵中氧是否足夠的度量，了解菌對(duì)氧利用的規(guī)律。,2,、溶氧作為發(fā)酵異常情況的指示,?,,溶氧一反往常，在較短的時(shí)間內(nèi)跌到零附近，且跌零后長(zhǎng)時(shí)間不回升，這很可能說(shuō)明污染了好氣菌,,?,,如發(fā)酵過(guò)程中溶氧迅速回升，發(fā)酵液變稀，則很可能是污染了噬菌體,3,、溶

19、氧作為發(fā)酵中間控制的手段之一,?,補(bǔ)糖后，溶氧出現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì),,?,因此可利用溶氧作為參數(shù)來(lái)控制加料的次數(shù)、流加速度和加入量,4,、溶氧作為考查設(shè)備、工藝條件對(duì)氧供需與產(chǎn)物形成影響的指標(biāo)之一,,二、適當(dāng)溶解氧的選擇,◆,在好氧微生物反應(yīng)中，一般取,[DO],＞,[DO],cri,,以,保證反應(yīng)的正常進(jìn)行,。,臨界氧濃度是不影響菌的呼吸所允許的最低氧濃度。,◆,,氧的滿足度,——,實(shí)際溶解氧濃度與臨界氧濃度之比。,,合適溶解氧選擇的原則：,,如果要使菌體快速生長(zhǎng)繁殖（如發(fā)酵前期），則應(yīng)達(dá)到臨界氧濃度；如果要促進(jìn)產(chǎn)物的合成，則應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)的目的不同，使溶解氧控制在最適濃度（不同的滿足度）,例如：

20、,,黃色短桿菌可生產(chǎn)多種氨基酸 ，但要求的氧濃度可能不同,?,,對(duì)谷氨酸和天門冬氨酸的生產(chǎn)，當(dāng)溶解氧濃度低于臨界氧濃度時(shí)，氨基酸產(chǎn)量下降，也就是說(shuō)要求氧的滿足度,= 1,?,但對(duì)于苯丙氨酸、纈氨酸和亮氨酸的生產(chǎn)，則在低于臨界氧濃度時(shí)獲得最大生產(chǎn)能力，它們的最佳氧濃度分別為臨界氧濃度的,0.55,、,0.66,、,0.85,。,,三、發(fā)酵液中溶解氧的控制,,培養(yǎng)液中溶解氧濃度的任何變化都是供需平衡的結(jié)果，因此調(diào)節(jié)發(fā)酵液中溶氧量不外乎從供、需兩方面考慮、著手,,G/,? =,K,L,a,· V · (C* - C,L,),G ---,溶解于液體中的氧量，,mmol,,? ---,氣,-,液接觸時(shí)

21、間，,h,,V ---,培養(yǎng)液的體積，,L,,C,L,,---,液相中氧的濃度，,mmol,/L,,C* ---,與氣相中氧分壓相平衡的液相中的氧飽和濃度，,mmol,/L,,K,L,---,以濃度差表示推動(dòng)力的傳質(zhì)系數(shù)（氧傳質(zhì)系數(shù)），,m/h,,a---,比表面積（即單位體積的液體中所含的氣,-,液接觸面積），,m,2,/m,3,,,1,、供氧方面,1,）增加空氣中氧的含量，使氧分壓增加，進(jìn)行富氧通氣,,富氧,空氣制備：,,深冷分離法 （可得,99.9%),,,吸附分離法 （吸去,N,2,和,CO,2,),,,膜分離法 （有機(jī)物高分子膜；,30%,）,,成本高，易爆炸 ；但關(guān)鍵時(shí)期使用

22、也是明智的,2,）提高罐壓,?,但同時(shí)會(huì)增加,CO,2,的溶解度（比氧氣高,30,倍），影響,pH,、,可能會(huì)影響菌的代謝。,,?,一般,0.3,～,1,kg /cm,2,3,）改變通氣速率,4,）增加攪拌速度,,2,、需,氧,方面,,rO,2,=Q,O2,·X,1,）調(diào)整養(yǎng)料的濃度,2,）調(diào)節(jié)控制溫度,Note,：,溶氧濃度必須與其它參數(shù)配合起來(lái)分析,,第五節(jié),,泡沫對(duì)發(fā)酵的影響及控制,,一、泡沫對(duì)發(fā)酵的影響,1,）降低了發(fā)酵罐的裝液系數(shù),,2,）增加了菌群的非均一性,,3,）增加了污染雜菌的機(jī)會(huì),,4,）導(dǎo)致產(chǎn)物的損失,,二、起泡機(jī)理,?,當(dāng)氣體通入純水的氣,-,液界面時(shí)，氣泡只能維持幾分

23、之一秒，其穩(wěn)定性等于零，這是由于能學(xué)上的不穩(wěn)定性和圍繞氣泡的液膜強(qiáng)度很低所致。,,?,,當(dāng)氣體通入起泡劑液體，因這些物質(zhì)具有某些親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)，分子帶極性的一端向著水溶液，而非極性一端向著空氣，并力圖在表面作定向排列，增加了泡沫的機(jī)械強(qiáng)度。,,?,培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)以及微生物菌體等為起泡物質(zhì)，具有穩(wěn)定泡沫的作用,,?,培養(yǎng)基的成分、溫度、酸堿度、濃度及泡沫的表面積對(duì)泡沫的穩(wěn)定性都有一定影響,,三、泡沫的消長(zhǎng)規(guī)律及影響因素,1,、消長(zhǎng)規(guī)律,◇,發(fā)酵過(guò)程中泡沫的消長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的規(guī)律,,,◇,但不同微生物的不同發(fā)酵通常不同,,2,、影響泡沫的因素,1,）與通氣量、通氣速度和攪拌速度等有關(guān),2,）與所

24、用培養(yǎng)基的成分有關(guān),玉米漿、蛋白胨、花生餅粉、黃豆餅粉、酵母粉、糖蜜是主要的發(fā)泡因素；且起泡能力隨品種、產(chǎn)地、貯藏和加工條件而不同。,3,）與培養(yǎng)基的滅菌方法、滅菌溫度和時(shí)間有關(guān),例如：,糖蜜培養(yǎng)基從,110℃,升高到,130℃,（皆為,30,分鐘），發(fā)泡系數(shù)增加一倍,,四、泡沫的控制,一） 機(jī)械消泡,內(nèi)部：耙式、梳齒式、渦輪式,,外部：離心式、碟片式,優(yōu)點(diǎn)：,,不需引入外界物質(zhì)（如消泡劑），可減少培養(yǎng)液性質(zhì)復(fù)雜化程度，便于產(chǎn)物的提取。,,缺點(diǎn)：,,不能從根本上消除引起穩(wěn)定泡沫的因素,,二） 化學(xué)消泡,1,、消泡機(jī)理,1,）降低泡沫的機(jī)械強(qiáng)度，使泡沫破裂,2,）降低液膜的表面黏度，使液膜的液體

25、流失，導(dǎo)致泡沫破裂,當(dāng)泡沫表層存在著由極性的表面活性物質(zhì)形成的雙電層時(shí)，可以加入另一種具有相反電荷的表面活性劑，以降低泡沫的機(jī)械強(qiáng)度；或加入某些具有強(qiáng)極性的物質(zhì)與發(fā)泡劑爭(zhēng)奪膜上的空間，降低液膜強(qiáng)度，使泡沫破裂。,當(dāng)泡沫的液膜具有較大的表面黏度時(shí)，可以加入某些分子內(nèi)聚力較小的物質(zhì)，以降低液膜黏度,,2,、消泡劑選擇的原則：,① 對(duì)發(fā)酵過(guò)程無(wú)毒，對(duì)人、畜無(wú)害，不影響生物合成。,,② 消泡作用迅速，效果高和持久性能好。,,③ 能耐高壓蒸汽滅菌而不變性，在滅菌溫度下對(duì)設(shè)備無(wú)腐蝕性或不形成腐蝕性產(chǎn)物。,,④ 不影響以后的提煉過(guò)程。,,⑤ 不干擾分析系統(tǒng)，如溶解氧、,pH,測(cè)定儀的探頭。,,⑥ 消泡劑的來(lái)

26、源多，價(jià)格低，添加裝置簡(jiǎn)單。,,⑦ 最好還能做到不影響氧的傳遞。,,1,）天然油脂,3,、消泡劑的種類,常用豆油、玉米油、米糠油,（能兼作碳源）,2,）聚醚類,3),高級(jí)醇類,主要是十八醇,4,）硅酮類,?,主要是聚二甲基硅氧烷及其衍生物,,?,結(jié)構(gòu)通式為,:,(,CH,3,),3,Si[,Si,(CH,3,),2,],nSi,(CH,3,),3,,,?,單獨(dú)使用效果差，常與分散劑（微晶二氧化硅）一起使用,,3,、消泡劑的使用,1,）分散,◇,消沫劑的消沫效果與使用方式很有關(guān)系。,,◇,消沫劑加到發(fā)酵罐中能否起作用取決于它的擴(kuò)散能力。,,◇,消沫劑的分散可借助于機(jī)械方法，也可加入某種分散劑將消

27、沫劑乳化成細(xì)小液滴。,2,）加量,,聚醚類,0.03,～,0.035%,3),加入時(shí)機(jī),有的可先加入培養(yǎng)基；有的則在泡沫初起或大起時(shí)加入,,第六節(jié),,雜菌與噬菌體的防治,,,◇,純種發(fā)酵（單菌或混菌）；菌種以外的微生物都被視為雜菌。,,,◇,所謂染菌，是指在發(fā)酵培養(yǎng)基中侵入了有礙生產(chǎn)的其它微生物。,,,◇,幾乎所有的發(fā)酵工業(yè)都有可能遭遇雜菌或噬菌體的污染。染菌的結(jié)果，輕者影響產(chǎn)量或質(zhì)量，重者可能導(dǎo)致倒罐，甚至停產(chǎn)，造成原料、人力和設(shè)備動(dòng)力的浪費(fèi)。,,防止雜菌和噬菌體污染是保證發(fā)酵正常進(jìn)行的關(guān)鍵之一,,一、雜菌污染的原因與防治,,1,、 從染菌的現(xiàn)象分析染菌的原因,,,1,）從染菌的時(shí)間分析,●

28、,早期（如接種后,12,h,或,24,h,），,除了種子帶菌外，主要是培養(yǎng)基或設(shè)備滅菌不徹底。,,●,相反，中、后期染菌則可能與中間補(bǔ)料、設(shè)備滲漏以及操作不合理等有關(guān)，也可能是空氣過(guò)濾器不嚴(yán)所致。,2,）從污染的雜菌類型分析,●,污染耐熱的芽孢桿菌，多數(shù)是因培養(yǎng)基滅菌不徹底或設(shè)備存在死角所致；,,●,污染無(wú)芽孢桿菌、球菌等不耐熱菌，可能是從蒸汽的冷凝水中帶來(lái)的，或空氣系統(tǒng)不嚴(yán)造成。,3,）從發(fā)酵罐及批次分析,大批發(fā)酵罐染菌是指整個(gè)工廠各個(gè)產(chǎn)品的發(fā)酵罐都出現(xiàn)雜菌現(xiàn)象，而且染的是同一種菌，主要是空氣過(guò)濾器除菌不凈，空氣帶菌而造成的。,個(gè)別發(fā)酵罐連續(xù)染菌，較多地是由于設(shè)備問(wèn)題而造成的。如閥門的滲漏或

29、罐體破損，特別是蛇形管的穿孔，有時(shí)不易察覺(jué)。有時(shí)設(shè)備破損引起的染菌會(huì)出現(xiàn)每批染菌時(shí)間前移現(xiàn)象。,個(gè)別發(fā)酵罐偶然染菌的原因最為復(fù)雜，各種染菌途徑都有可能引起。,,,根據(jù)谷氨酸發(fā)酵情況分析，染菌原因以設(shè)備問(wèn)題（設(shè)備滲漏、管道不嚴(yán)、設(shè)備死角）和空氣問(wèn)題（過(guò)濾器不嚴(yán)、過(guò)濾器失效、過(guò)濾器受潮）為主，種子（二級(jí)種子染菌）次之，而培養(yǎng)基消毒不透的情況較少。,,2,、 防止染菌要點(diǎn),（,1,）空氣系統(tǒng),提高空壓機(jī)進(jìn)口空氣的潔凈度、防止空氣帶油、水及過(guò)濾器失效。,,如提高空壓機(jī)吸氣口位置并加強(qiáng)壓縮前的過(guò)濾；防止空氣冷卻器漏水而進(jìn)入空氣系統(tǒng)；在空氣過(guò)濾器滅菌時(shí)要防止沖翻介質(zhì)而短路，防止烤焦介質(zhì)或著火；裝填纖維介質(zhì)

30、時(shí)要壓緊；操作中要防止空氣的壓力劇變和流速激增等。,,,（,2,）設(shè)備,●,發(fā)酵罐及其附屬設(shè)備應(yīng)注意嚴(yán)密和防止泄漏，避免形成“死角”。與物料、空氣、下水道連接的閥門皆需保證嚴(yán)密度。,,,●,,用超凈工作臺(tái)及凈化室代替無(wú)菌室，以提高無(wú)菌程度。,,,●,,連消設(shè)備的連消塔要簡(jiǎn)單，易拆裝清理，操作時(shí)蒸汽能與物料均勻混合，并易控溫度；維持罐在料液輸送時(shí)培養(yǎng)基在罐中能均勻地緩慢上升，不走短路。,,（,3,）工藝操作,,① 空罐準(zhǔn)備,,,,放罐后應(yīng)進(jìn)行全面檢查和清洗。要清理罐內(nèi)殘?jiān)?，去除罐壁污垢，清除空氣分布管、溫度?jì)套管等處堆積的污垢及罐內(nèi)的“死角”。要防止端面軸封漏氣、攪拌添料箱及閥門滲漏等。蛇管和夾

31、層要按設(shè)計(jì)規(guī)定的壓力定期試壓?？障麜r(shí)應(yīng)先將罐內(nèi)空氣排盡，保持蒸汽暢通，閥門、管道均要徹底滅菌。,② 實(shí)罐滅菌,,,,配制培養(yǎng)基時(shí)要防止原料結(jié)塊。配料罐出口應(yīng)有篩板過(guò)濾器（篩孔直徑≤,0.5mm,），,以防塊狀物及異物進(jìn)入罐內(nèi)。滅菌時(shí)，要保證各路進(jìn)氣暢通及罐內(nèi)料液翻騰激烈，控制好溫度與壓力，嚴(yán)防泡沫冒頂及料液倒流到空氣系統(tǒng)中。,,,③ 連消,,,,料液進(jìn)入連消塔前需先預(yù)熱。滅菌過(guò)程中，料液溫度及其在維持罐停留的時(shí)間都必須符合要求，確保滅菌徹底。當(dāng)冷卻管開放冷水時(shí)，防止因突然冷卻造成負(fù)壓而吸入外界空氣。為確保滅菌溫度穩(wěn)定，連消必須實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制。,,④ 補(bǔ)料,,,,補(bǔ)入發(fā)酵罐內(nèi)的料液一定要保證無(wú)菌。

32、,⑤ 種子,,,,有關(guān)種子操作的制度要嚴(yán)格遵守；搖瓶瓶塞要確保嚴(yán)密。,,⑥ 無(wú)菌試驗(yàn),,,,無(wú)菌試驗(yàn)要嚴(yán)格取樣操作，力求減少誤差。應(yīng)同時(shí)用肉湯和雙碟作對(duì)照，以便迅速作出判斷。當(dāng)發(fā)現(xiàn)染菌時(shí)，要通過(guò)分辨菌型來(lái)探索菌源，并對(duì)雜菌做耐熱試驗(yàn)考察。如果懷疑種子罐染菌，則種子不能輕率進(jìn)發(fā)酵罐。,,,3,、 無(wú)菌檢查與染菌的處理,,為了防止在種子培養(yǎng)或發(fā)酵過(guò)程中污染雜菌，在接種前后、種子培養(yǎng)及發(fā)酵過(guò)程中分別進(jìn)行無(wú)菌檢查，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)染菌，并在染菌后及時(shí)進(jìn)行必要處理是很重要的。,,（,1,）無(wú)菌檢查,,◆,,染菌通常通過(guò),3,個(gè)途徑發(fā)現(xiàn)：無(wú)菌試驗(yàn)、發(fā)酵液直接鏡檢、發(fā)酵液的生化分析。其中無(wú)菌試驗(yàn)是判斷染菌的主要

33、依據(jù)。,,,,◆,,無(wú)菌試驗(yàn)方法有雙碟培養(yǎng)、斜面培養(yǎng)、肉湯培養(yǎng)等，其中以雙碟和肉湯培養(yǎng)為主。,,（,2,）染菌的判斷,,◆,以肉湯和雙碟培養(yǎng)的反應(yīng)為主，鏡檢為輔。,,,◆,每,8h,一次的無(wú)菌檢查，至少用,2,只酚紅肉湯及,1,只雙碟同時(shí)取樣。,,,◆,無(wú)菌試驗(yàn)時(shí)，如果肉湯連續(xù),3,次變色（紅→黃）或產(chǎn)生渾濁，或雙碟培養(yǎng)連續(xù),3,次有雜菌菌落，即判斷為染菌。,,,（,3,）染菌率的統(tǒng)計(jì),,,以發(fā)酵罐染菌批（次）為基準(zhǔn)，染菌罐批（次）應(yīng)包括染菌重消的重復(fù)染菌批（次）在內(nèi)。整個(gè)發(fā)酵周期中，無(wú)論前期或后期染菌，均作“染菌”論處。,發(fā)酵（罐）染菌批（次）,,,總投罐批（次）,染菌率（,%,）,=,,?

34、,100%,,,（,4,）染菌的處理,,,發(fā)現(xiàn)染菌后，應(yīng)立即根據(jù)染菌的種類及產(chǎn)生菌的菌齡等具體情況分別進(jìn)行處理。除據(jù)染菌時(shí)間及危害程度對(duì)污染罐進(jìn)行挽救或處理外，對(duì)有關(guān)設(shè)備也應(yīng)進(jìn)行處理。,◆,發(fā)酵中后期染菌或前期染菌輕微而發(fā)現(xiàn)較晚時(shí)，可加入適當(dāng)?shù)臍⒕鷦┗蚩股?；或把高單位的后期發(fā)酵液壓一部分到染菌罐中，抑制雜菌生長(zhǎng)速度；或者降低罐溫，減緩雜菌繁殖速度。,◆,種子罐染菌后，種子不能再接入發(fā)酵罐中，這時(shí)可用備用種子接種。如無(wú)備用種子，則可選一適當(dāng)培養(yǎng)齡的發(fā)酵罐培養(yǎng)物作種子，即生產(chǎn)上所說(shuō)的“倒種”。,◆,發(fā)酵罐前期染菌后，如培養(yǎng)基中,C,、,N,含量尚高，則可重新滅菌，接種后再運(yùn)轉(zhuǎn)；若染的雜菌危害性較

35、大，則放掉部分料液，補(bǔ)入新料液，重新滅菌、接種。,,二、噬菌體污染的防治,,在國(guó)內(nèi)外，發(fā)酵工業(yè)中噬菌體的危害是一個(gè)普遍的問(wèn)題。對(duì)于丙酮丁醇、氨基酸、酶制劑和抗生素等發(fā)酵都有噬菌體的危害，所帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失是相當(dāng)驚人的。,,1,、噬菌體的污染源,,◆,噬菌體廣泛地存在于適合宿主生存的泥土、污水和空氣中；,,,◆,發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)菌的噬菌體可以從異常發(fā)酵液和工廠環(huán)境中分離出來(lái)，溶源性細(xì)菌也混雜在工廠周圍環(huán)境的細(xì)菌中；,,,◆,一個(gè)新的發(fā)酵工廠往往在投產(chǎn)不久便會(huì)出現(xiàn)噬菌體污染；,,,◆,研究認(rèn)為，當(dāng)有許多細(xì)菌存在時(shí)，相應(yīng)的噬菌體就會(huì)馬上出現(xiàn)，其濃度在自然條件下很容易增高。,,,◆,,工廠本身的排放物有時(shí)也

36、給重復(fù)污染提供了噬菌體來(lái)源。生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)酵氣體排出，可以帶有大量的生產(chǎn)菌。,,,,◆,在生產(chǎn)罐污染有少量噬菌體（尚可進(jìn)行生產(chǎn)）時(shí)，噬菌體也被排到環(huán)境中，造成惡性循環(huán)。,,,,◆,廢棄的發(fā)酵液處理不當(dāng)可以成為難以對(duì)付的污染源。,,2,、 噬菌體污染與發(fā)酵異常,,,噬菌體污染后的情況因發(fā)酵工業(yè)的種類、污染的噬菌體特性、污染時(shí)間、感染復(fù)度（即培養(yǎng)物內(nèi)的噬菌體與細(xì)菌的比率）、培養(yǎng)基成分、發(fā)酵罐內(nèi)的物理和化學(xué)條件不同而異。即使同樣的噬菌體并不一定引起同樣的異常發(fā)酵情況。,,一般來(lái)說(shuō)，噬菌體污染引起的異常發(fā)酵有以下表現(xiàn)：,,,（,1,）污染較輕，或在發(fā)酵末期污染，則使發(fā)酵過(guò)程減慢或降低發(fā)酵產(chǎn)率。也有的行業(yè)

37、在這種情況下產(chǎn)率反而增高；,,,,（,2,）在細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期污染，而且污染量大，就會(huì)造成細(xì)菌溶解，發(fā)酵終止。,,,噬菌體污染后可以觀察到糖消耗減慢，,pH,異常變化，產(chǎn)氣減少，發(fā)酵稀薄，繼之活的生產(chǎn)菌減少。通過(guò)測(cè)定可過(guò)濾性、傳染性、宿主特異性、溶菌斑形成能力和電鏡觀察來(lái)鑒別異常發(fā)酵中的噬菌體。,,,3,、噬菌體污染的防治,,發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中噬菌體污染是一個(gè)復(fù)雜的問(wèn)題，雖然至今還沒(méi)有完全滿意地解決這一問(wèn)題，但采取一些措施來(lái)防治噬菌體的污染，也有一定的成效。,（,1,）防止噬菌體入侵和蔓延,,發(fā)酵工廠生產(chǎn)菌的噬菌體廣泛存在于其周圍環(huán)境中，為了防止噬菌體的污染，保持周圍環(huán)境的清潔是必要的，所有設(shè)備和設(shè)

38、施如發(fā)酵罐、管道系統(tǒng)等要進(jìn)行滅菌處理。,,妥善地保藏菌種、對(duì)原料和水進(jìn)行無(wú)菌處理、對(duì)工廠空氣、種子、發(fā)酵液、泥土和污水的噬菌體濃度進(jìn)行日常檢查，即使空氣中噬菌體濃度極低時(shí)，也要進(jìn)行檢測(cè)。,,,噴灑氯化物或殺藻胺,(,benzalkonium,chloride),氣溶膠能殺滅活噬菌體，紫外線照射用作一種額外的保護(hù)措施。漂白粉,(0.2%),、陽(yáng)離子表面活性劑（如季銨鹽,0.01%,?,0.1%,）和福爾馬林（,1%,）均可單獨(dú)使用，如果必要也可聯(lián)合使用。,,（,2,）選用抗噬菌體突變株,抗噬菌體突變株應(yīng)具備以下特征：,,,1,）對(duì)以前出現(xiàn)過(guò)的噬菌體都具有抗性；,,2,）為非溶源菌；,,3,）具有

39、與原始菌株相當(dāng)或更高的生產(chǎn)能力；,,4,）沒(méi)有回復(fù)突變成噬菌體敏感株的能力。,,對(duì)付噬菌體污染的一個(gè)措施就是分離抗正在污染的噬菌體的細(xì)菌突變株，用于發(fā)酵生產(chǎn)上。,,（,3,）使用抑制噬菌體復(fù)制的化學(xué)藥物,,藥物必須具有以下性質(zhì)：,,,① 選擇性抑制噬菌體而不影響宿主菌生長(zhǎng)或發(fā)酵過(guò)程；,,② 在食品發(fā)酵工業(yè)上要求該化學(xué)物質(zhì)不影響產(chǎn)品質(zhì)量；,,③ 用量要小，要經(jīng)濟(jì)。,,◆,,有些噬菌體感染需要雙價(jià)陽(yáng)離子,(Ca,2+,、,Mg,2+,),吸附或,DNA,注射才能進(jìn)行。使用絡(luò)合劑可獲得較好的效果，如,0.2-0.3%,多磷酸鈉、,0.1-0.2%,肌醇六磷酸,(,phytic,acid),、,0.2

40、-0.5%,檸檬酸或草酸等可抑制乳糖發(fā)酵短桿菌的噬菌體。,◆,,非離子去污劑如聚乙烯二醇酯酸、聚羥乙烯烷基醚、吐溫,20,、吐溫,60,均能明顯地抑制噬菌體吸附、復(fù)制，或引起流行性感染。,◆,,有些抗生素能抑制多種噬菌體，氯霉素（,1,?,g/ml,）,對(duì)丙酮丁醇乳酸棒桿菌的,HM,噬菌體有良好的抑制作用，對(duì)宿主菌無(wú)影響。,,第 七 節(jié),,發(fā) 酵 終 點(diǎn) 的 判 斷,,不同類型的發(fā)酵，要達(dá)到的目標(biāo)不同，因而發(fā)酵終點(diǎn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)也不同,,1,） 一般對(duì)發(fā)酵及原材料成本占整個(gè)生產(chǎn)成本主要部分,,的發(fā)酵產(chǎn)品，主要追求提高：,,,產(chǎn)率 （,kg / m,3,·h),,,得率 （,Kg,產(chǎn)物,/ kg,基

41、,質(zhì)）,,發(fā)酵系數(shù) （,kg,產(chǎn)物,/,罐容積,m,3,·,發(fā)酵周期,h,）,2,）如下游提取、精制占主要部分，則除了要求高的,產(chǎn)率,和,,發(fā)酵系數(shù),外，還要求高的,產(chǎn)物濃度,。,,t,T,—,培養(yǎng)放罐、檢修的工作時(shí)間,,t,D,,—,打料、滅菌時(shí)間,,t,L,,—,停滯期,分批培養(yǎng)的生產(chǎn)率,,發(fā)酵總的生產(chǎn)周期：,,,,t = 1/,μ,m,lnX,f,/X,0,+,t,T,+,t,L,+,t,D,t,T,—,培養(yǎng)放罐、檢修的工作時(shí)間,,t,D,,—,打料、滅菌時(shí)間,,t,L,,—,停滯期,,X,0,和,X,f,——,起始和終了時(shí)的細(xì)胞濃度；,,μ,m,——,最大比生長(zhǎng)速率,,◆,,如要提高總的生產(chǎn)率則有必要縮短發(fā)酵周期,。,,,就是要在產(chǎn)物合成速率較低時(shí)放罐，延長(zhǎng)發(fā)酵雖然略能提高產(chǎn)物濃度，但生產(chǎn)率下降，且消耗每千瓦電力，每噸冷卻水所得產(chǎn)量也下跌，成本提高。,◆,,放罐時(shí)間對(duì)下游工序有很大影響,,放罐時(shí)間過(guò)早，會(huì)殘留過(guò)多的養(yǎng)分，如糖、脂肪、可溶性蛋白等，對(duì)提取不利，這些物質(zhì)能增加乳化作用或干擾樹脂的交換；,,放罐時(shí)間太晚，菌絲自溶，不僅會(huì)延長(zhǎng)過(guò)濾時(shí)間還會(huì)使一些不穩(wěn)定的抗生素單位下跌，擾亂提取工段的作業(yè)計(jì)劃。,,