基因工程的基本操作程序 PPT課件
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1.2 基因工程的基本操作程序,原理:基因工程是指按照人們的愿望,進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì),通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù),賦予生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品。(既是概念,又是原理),基因重組,1,,,,,基因工程基本操作的四個(gè)步驟,1、目的基因的獲取,2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,4、目的基因的檢測(cè)與鑒定,2,一、目的基因的獲取,1、目的基因主要是指______________________,編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,2、獲取目的基因的常用方法有哪些?,(3)人工合成,(1)從基因文庫(kù)中獲取,(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增,3,(一)從基因文庫(kù)中獲取目的基因,將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷,導(dǎo)入到受體菌的群體中,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因,稱(chēng)為基因文庫(kù),1.基因文庫(kù),4,,基因組文庫(kù)與部分基因文庫(kù)的關(guān)系,,怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需的目的基因呢?,5,① 概念:PCR全稱(chēng)為_(kāi)______________,是一項(xiàng) 在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù),③條件:_______________________、 _______________、___________ 、 ___________.,②原理:__________,④方式:以_____方式擴(kuò)增,即____(n為擴(kuò)增循 環(huán)的次數(shù)),⑤結(jié)果:,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),體外,特定DNA片段,DNA復(fù)制,已知基因的核苷酸序列,四種脫氧核苷酸,一對(duì)引物,耐熱的DNA聚合酶(Taq酶),指數(shù),2n,使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增,(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,6,⑥過(guò)程:,a、DNA變性(90℃-95℃):雙鏈DNA模板 在熱作用下,_____斷裂,形成___________,b、退火(復(fù)性55℃-60℃):系統(tǒng)溫度降低,引 物與DNA模板結(jié)合,形成局部________。,c、延伸(70℃-75℃):在Taq酶的作用下,從 引物處延伸,合成與模板互補(bǔ) 的________。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,7,8,(三)通過(guò)DNA合成儀直接合成目的基因,DNA合成儀,蛋白質(zhì)的氨基酸順序,mRAN 核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的 基因,,,,推測(cè),推測(cè),合成,當(dāng)基因比較小、蛋白質(zhì)的氨基酸序列可以測(cè)得或核苷酸序列已知時(shí),可采用此種方法。,9,二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心,目的:,使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳給下一代,同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。,它們各自的作用是什么?,10,2、表達(dá)載體的組成 啟動(dòng)子 終止子 目的基因 標(biāo)記基因等,,11,,質(zhì)粒,,目的基因,,限制酶,,12,,質(zhì)粒,DNA分子,,限制酶處理,,,一個(gè)切口 兩個(gè)黏性末端,兩個(gè)切口 獲得目的基因,DNA連接酶,重組DNA分子(重組質(zhì)粒),,—— 核心,同一種,二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建,3.過(guò)程:,13,,,14,1、將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法:農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 (1)農(nóng)桿菌特點(diǎn): (2)原理、過(guò)程,三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,雙子葉植物,15,,,,,16,2、將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞 (1)方法:顯微注射法 (2)程序:,(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞,目的基因表達(dá)載體提純 取卵(受精卵) 顯微注射 受精卵 新性狀動(dòng)物,,,,,,17,18,3、將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞,(1)原核生物特點(diǎn):繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少 (2)方法:Ca2+處理,用Ca2+處理細(xì)胞 感受態(tài)細(xì)胞 表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合 感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子,,,,19,(四)目的基因的檢測(cè)與鑒定,——檢查是否成功,檢測(cè)— (分子 水平),鑒定—— (個(gè)體水平),,①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因 復(fù)制,②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA,③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì),抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定,方法——,方法——,方法——,DNA分子雜交,分子雜交(注意與上不同之處),抗原抗體雜交,病原體感染法 (接種實(shí)驗(yàn)法),,,,20,(二)個(gè)體水平,例:用棉鈴飼喂棉鈴蟲(chóng),如蟲(chóng)吃后不出現(xiàn)中毒癥狀,說(shuō)明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲(chóng)吃后中毒死亡,則說(shuō)明攝入了抗蟲(chóng)基因并得到表達(dá)。,21,22,,,,23,,,24,思考與探究,1、不可以。因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用, 還需要有其他控制元件,如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。必須 構(gòu)建上述元件的主要理由是: (1)生物之間進(jìn)行基因交流,需使用啟動(dòng)子和終止子才能比較有 利于基因的表達(dá)。如通過(guò)CDNA文庫(kù)獲得的目的基因沒(méi)有啟動(dòng)子, 只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中,此目的基因無(wú)法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。 (2)目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記。 (3)為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平,往往還要增加一些其他調(diào)控 元件,如增強(qiáng)子等。 (4)有時(shí)需要目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位,往往 要加上可以標(biāo)識(shí)存在部位的基因(或做成目的基因與標(biāo)識(shí)基因的 融合基因),如綠色熒光白基因等。,25,思考與探究,2、農(nóng)桿菌中不同的菌株侵染能力有差別,在基因工程中需要加以 選擇使用。利用農(nóng)桿菌侵染單子葉植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí),是需要加 上酚類(lèi)化合物,(也就是說(shuō)單子葉植物不能合成酚類(lèi)化合物) 對(duì)于單子葉植物不同的種類(lèi),農(nóng)桿菌侵染進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的效果也有 很大差異。 如果想將一個(gè)抗病基因轉(zhuǎn)入小麥,也可以用農(nóng)桿菌,但要注意兩點(diǎn) ?要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株,因?yàn)椴皇撬械霓r(nóng)桿菌菌株都可在 侵染單子葉植物; ?要加趨化和誘導(dǎo)的物,一般為乙酰丁香酮等,目的是使農(nóng)桿菌向 植物組織的受傷部位靠攏(趨化性)和激活農(nóng)桿菌的Vir區(qū)(誘導(dǎo)性) 的基因,使T-DNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體DNA上。,26,思考與探究,3、有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈,這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和 高爾基體復(fù)合體上加工完成的,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體復(fù)合體存在于真 核細(xì)胞中,大腸桿菌不存在這兩種細(xì)胞器,因此,在大腸桿菌中生 產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的。,4、基本操作如下。 (1)從小鼠中克隆出β-珠蛋白基因的編碼序列(CDNA) (2)將 CDNA前接上在大腸桿菌中可以適用的啟動(dòng)子,另入加上 抗四環(huán)素的基因,構(gòu)建成一個(gè)表達(dá)載體。 (3)將表達(dá)載體導(dǎo)入無(wú)四環(huán)素抗性的大腸桿菌中,然后在含有四環(huán) 素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。如果表達(dá)載體未進(jìn)入大腸菌中,大腸 桿菌會(huì)因不含有抗四環(huán)素基因而死掉;如果培養(yǎng)基上長(zhǎng)出大腸桿菌 菌落,則表明β-珠蛋白基因已進(jìn)入其中。 (4)培養(yǎng)進(jìn)入了β-珠蛋白基因的大腸桿菌收集菌體,破碎后從中 提取β-珠蛋白。,27,1)以下說(shuō)法正確的是 ( ) A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列 B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體 C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是:具有多個(gè)限制酶切點(diǎn),以便與外源基因連接 D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來(lái),C,練習(xí),28,2)有關(guān)基因工程的敘述中,錯(cuò)誤的是( ) A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對(duì)連接起來(lái) B、 限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得 C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞 D、 人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶,A,練習(xí),29,3)有關(guān)基因工程的敘述正確的是 ( ) A、限制酶只在獲得目的基因時(shí)才用 B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成 C、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體 D、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料,D,練習(xí),30,4)基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的。在基因操作的基本步驟中,不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是 ( ) A、人工合成目的基因 B、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合 C、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 D、目的基因的檢測(cè)和表達(dá),C,練習(xí),31,- 1.請(qǐng)仔細(xì)閱讀文檔,確保文檔完整性,對(duì)于不預(yù)覽、不比對(duì)內(nèi)容而直接下載帶來(lái)的問(wèn)題本站不予受理。
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