一用亞硫酸鈉氧化法測定氣液接觸過程的體積傳質(zhì)系數(shù)

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1、 《生物反應(yīng)工程》實驗講義及實驗報告 班級： 學號： 姓名： 成績： 實驗一 游離酶與固定化酶酶學性質(zhì)比較 實驗?zāi)康模? 掌握測定酶動力學參數(shù)的實驗方法，作圖法計算酶動力學參數(shù)，掌握固定化酶的方法，以及固 定化酶后動力學參數(shù)的變化。 實驗原理

2、： 要建立一個完整的酶動力學方程，必須要通過動力學實驗確定其動力學參數(shù)。對 M —M 方程， 就是要確定 r max 和 Km 值。但直接應(yīng)用 M — M 方程求取動力學參數(shù)所遇到的主要困難在于該方程為 一非線性方程。為此常將該方程加以線性化，通過作圖法直接求取動力學參數(shù)。通常有下述幾種作 圖方法。 Lineweaver — Burk 法 (簡稱 L-B 法 )。將 M — M 方程取其倒數(shù)得到下式： 1 1 K m 1 (1) rs rmax Cs rmax 以 1

3、／ rs 對 1 ／ Cs 作圖可得一直線， 該直線斜率為 Km ／ r max ，直線與縱軸交于 1 ／ r max ，與橫軸 交于一 1 ／ Km 。此法又稱雙倒數(shù)圖解法。 Hanes — Woo1f 法 (簡稱 H —W 法)。將式 (1) 兩邊均乘以 Cs 得到 C s K m C s (2) rs rm ax rm ax 以 Cs／ r s 對 Cs 作圖，得一斜率為 1 ／ r max 的直線， 直線與縱軸交點為 Km ／ rmax ，與橫軸交點為 一 Km 。

4、 (3)Eadie —Hofstee 法(簡稱 E-H 法 )。將 M — M 方程重排為 rs rsrmax K m C s （ 3） ２ 以 r s 對 r s／ Cs 作圖，得一斜率為一 Km 的直線， 它與縱鈾交點為 r max ，與橫軸交點為 r max ／ Km 。 固定化酶亦稱固相酶或水不溶酶。它是通過物理或化學的方法使溶液酶轉(zhuǎn)變?yōu)樵谝欢ǖ目臻g內(nèi) 其運動受到完全約束、或受到局部約束的一種不溶于水，但仍具活性的酶。

5、它能以固相狀態(tài)作用于 底物進行催比反應(yīng)。 固定化酶的主要優(yōu)點是，在催化反應(yīng)以后很容易從反應(yīng)系統(tǒng)中分離出來，不僅固定化酶可以反 復(fù)使用，而且產(chǎn)物不受污染容易精制，固定化后的酶大多數(shù)情況下其穩(wěn)定性增加，僅有少數(shù)的穩(wěn)定 性下降，固定化酶有一定的形狀和一定的機械強度，可以裝填在反應(yīng)器中長期使用，便于實現(xiàn)生產(chǎn) 連續(xù)化和自動化。固定化酶的制備方法可分為吸附法、交聯(lián)法、共價法、包埋法四大類。 如果固定化酶的動力學仍服從 M — M 方程，則可通過動力學參數(shù) Km 與 r max 值的大小來反映酶 在固定化前后活

6、性的變化。 儀器與試劑： 分光光度計、水浴鍋、酸性磷酸酯酶、磷酸苯二鈉、酚標準液、碳酸鈉溶液、費林－酚試劑、 卡拉膠 實驗步驟及數(shù)據(jù)記錄： 1、酚標準曲線的繪制。取 9 只試管，按照 0-8 的順序編號， 0 號為空白管。按照下表的過程 進行操作： 管號 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0.4mmol/L 酚標準液 0 mL 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 蒸餾水 1 0.9

7、 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 1mol/L 碳酸鈉溶液 2 2 2 2 2 2 2 2 2 費林－酚試劑 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 35 ℃顯色 10min A 680 ３ 2、酶動力學參數(shù)的求取。取 7 只試管，按照 0-6 的順序編號， 0 號為空白管。按照下表的過 程進行操作：℃ 管號 0 1 2 3 4 5

8、 6 5mmol/L 磷酸苯二鈉溶液 0 0.1 0.15 0.2 0.3 0.4 0.5 0.2mol/LpH5.6 乙酸鹽緩沖 0.5 0.4 0.45 0.3 0.2 0.1 0 液 酶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 35 ℃反應(yīng) 15min 1mol/L 碳酸鈉溶液 2 2 2 2 2 2 2 費林－酚試劑 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 35 ℃

9、顯色 10min A 680 3、酶固定化及動力學參數(shù)測定。稱取 0.8g 卡拉膠，溶解在 20mL 水中，加熱煮沸，冷卻到 50-60 ℃。 將在水浴鍋中保溫好的酶液 5mL 倒入， 并攪拌均勻， 冷卻，待完全固化后， 用 5% 的 KCl 溶液浸泡 30 min 。將浸泡好的固定化酶取出，濾紙吸干，用小刀將其切成 3 3mm 的小塊。稱取 固定化酶 5g 共 6 份，取 6 只 50mL 三角瓶，按照下表過程操作： 三角瓶號 0 1 2 3 4 5 5m

10、mol/L 磷酸苯二鈉溶液 0 1 3 5 7 9 0.2mol/LpH5.6 乙酸鹽緩沖 10 9 7 5 3 1 液 固定化酶 5 5 5 5 5 5 35 ℃搖床反應(yīng) 15min 1mol/L 碳酸鈉溶液 2 2 2 2 2 2 費林－酚試劑 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 35 ℃顯色 10min A 680

11、 實驗結(jié)果處理分析： 繪制酚標準曲線 ４ 計算游離酶動力學參數(shù) Cs A 680 酚含量 r s 1/Cs 1/r s Cs /r s r s /Cs 計算固定化酶動力學參數(shù) Cs

12、 A 680 ５ 酚含量 r s 1/Cs 1/r s Cs /r s r s /Cs 游離酶和固定化酶酶活力比較： 方法 L-B H-W E-H 游離酶 Km r max Km r max Km r max 參數(shù) 方法 L-B H-W E-H 固定化酶 Km r max Km r

13、max Km r max 參數(shù) 酶活回收率 有效因子 分析和討論： 1、 動力學參數(shù)作圖法求取的方法有那些？分別考慮其誤差來源。 （預(yù)習時填寫） ６ 2、 固定化酶的方法有那些？本實驗中采用的方法是什么？有什么優(yōu)點？ 實驗二 用亞硫酸鈉氧化法測定氣液接觸過程

14、 的體積傳質(zhì)系數(shù) k L a 實驗?zāi)康模? 在非發(fā)酵情況下，用亞硫酸鈉氧化法來測定發(fā)酵罐通氣或攪拌時的體積傳質(zhì)系數(shù)， 從而考察通氣、攪拌等因素對發(fā)酵罐內(nèi)氣液接觸過程的體積傳質(zhì)系數(shù) k L a 的影響。 儀器與試劑： 1、 發(fā)酵罐（攪拌或氣升式） 2、 碘量瓶 3、 移液管（ 1mL ） 4、 燒杯（ 50mL 、2000 mL ） ７ 5、 0.1mol L-1 碘液 6、 0.1 mol L-1 硫代硫酸鈉（

15、 Na 2 S2 O 3）溶液 7、 無水亞硫酸鈉 8、 硫酸銅 實驗原理 亞硫酸鈉溶液，在銅或鈷離子作為催化劑的作用下， 能與液相中的溶解氧迅速反應(yīng)， 使亞硫酸根離子氧化為硫酸根離子， 其氧化反應(yīng)速度在較大范圍內(nèi)與亞硫酸根離子濃度 無關(guān)。由于氧是較難溶解于水的氣體， 因而氧的溶解速度要比液相中的氧的消耗速度慢 的多，因此氧分子一經(jīng)滲入液相，就立即被還原，所以可以認為，在整個實驗中，液相 中的氧濃度可視為零，即有： Nv k L a(C * C ) kL aC * 在 25 ℃及

16、 0.1MPa 下，亞硫酸鈉溶液中，經(jīng)測定 C*=0.21mgO 2 L-1 。所以從上式可以看出，只要測得 Nv 值，就可以計算出 kL a 。 實驗時，在攪拌罐中配制一定濃度的亞硫酸鈉溶液，其體積視發(fā)酵罐的大小而定；在攪拌通氣或通氣情況下， 加入少量催化劑， 計時，取不同時刻的試樣與過量的碘溶液作用，多余的碘用表定過的硫代硫酸鈉來滴定， 根據(jù)消耗的硫代硫酸鈉溶液的體積， 可 以計算出單位時間內(nèi)氧的溶解量 Nv 值。上述過程的反應(yīng)式如下： 2 Na2 SO3 O2 2Na2 SO4 Na2 SO3 I 2 NaSO4 2HI 2 NaS2 O3 I

17、2 Na2 SO4 2NaI 實驗步驟： 1、 發(fā)酵罐清洗，試運轉(zhuǎn)，（對氣升式發(fā)酵罐要確定其最佳裝液量） ８ 2、 裝罐實驗：準確稱取 31.5g 亞硫酸鈉，放置燒杯中，用 1L 水溶解，待亞硫酸鈉全 部溶解后，倒入發(fā)酵罐中；準確稱取 0.5g 硫酸銅并溶解于少量水中，將硫酸銅溶液 倒入發(fā)酵罐中； 在室溫下，開動攪拌通氣或通氣攪拌， 調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速 n 和通氣量 Q； 開始計時，每隔一定時間 （5min ）取樣 1mL 分析其中的亞硫酸鈉含量 （取 5 個樣），

18、 測定其中的亞硫酸鈉含量。調(diào)節(jié)通氣量或攪拌轉(zhuǎn)速，重復(fù)上面的實驗，要求改變實 驗條件，做 3 個條件實驗。 數(shù)據(jù)記錄： 實驗結(jié)果記錄表 時間 (min) 5 10 15 20 25 條件 轉(zhuǎn)速： 氣量： 轉(zhuǎn)速： 氣量： 轉(zhuǎn)速： 氣量： 轉(zhuǎn)速： 氣量： 轉(zhuǎn)速： 氣量： 轉(zhuǎn)速： 氣量： 按照記錄數(shù)據(jù)進行繪圖： ９

19、 數(shù)據(jù)處理： 按照上面的數(shù)據(jù)，計算 Nv 和 kL a 轉(zhuǎn)速： 轉(zhuǎn)速： 轉(zhuǎn)速： 轉(zhuǎn)速： 轉(zhuǎn)速： 轉(zhuǎn)速： 條件 氣量： 氣量： 氣量： 氣量： 氣量： 氣量： V / t Nv （ ） kL a（ ） 繪制轉(zhuǎn)速 n 和 kL a 關(guān)系圖，或氣量 Q 和 kL a 關(guān)系圖

20、 １０ 分析和討論： 3、 討論分析轉(zhuǎn)速、通氣量、亞硫酸鈉濃度等因素對發(fā)酵罐體積傳質(zhì)系數(shù) kL a 的影響， 如何根據(jù)測定數(shù)據(jù)計算氧消耗速率 Nv 和體積傳質(zhì)系數(shù) k L a ；（預(yù)習時填寫） 4、 試分析實驗過程中的主要誤差來源，并提出今后實驗改進的意見。

21、 實驗三 微生物反應(yīng)器的反應(yīng)性能試驗 實驗?zāi)康模? 進一步了解和掌握生物反應(yīng)器 BSTR 和 CSTR 的反應(yīng)性能，了解和掌握微生物菌體 在反應(yīng)器中生長的規(guī)律，并了解反應(yīng)器的有關(guān)操作。 實驗原理： 間歇攪拌釜式反應(yīng)器是一類常用的微生物反應(yīng)器。其主要特征是分批進料和卸料， 因此其操作試劑由兩部分組成： 一是進行反應(yīng)所需的時間， 即開始進行反應(yīng)直至達到所 １１ 要求的反應(yīng)程度為止所需的時間。 由于攪拌的作用， 反應(yīng)

22、器內(nèi)的物料充分混合， 濃度均 勻，反應(yīng)器內(nèi)物系的組成僅隨反應(yīng)時間而變。對于菌體濃度而言，隨著反應(yīng)的進行，微 生物菌體的濃度不斷增加，其菌體濃度變化的規(guī)律基本上符合 Monod 方程。 連續(xù)攪拌釜式反應(yīng)器也是一類微生物反應(yīng)器， 其反應(yīng)性能和間歇反應(yīng)器有明顯的不 同。其主要特征是， 反應(yīng)物連續(xù)穩(wěn)定地加入到反應(yīng)器中， 同時反應(yīng)產(chǎn)物也連續(xù)穩(wěn)定地流 出反應(yīng)器，并保持反應(yīng)體積不變。 當反應(yīng)器操作達到穩(wěn)定時， 反應(yīng)器內(nèi)物系的組成不隨 時間而變，同時由于反應(yīng)器內(nèi)的攪拌， 使得物系在空間上達到充分混合， 物系組成也不 隨空間位

23、置而變， 此時反應(yīng)器內(nèi)物系的組成和反應(yīng)器出口的組成相同。 對應(yīng)于一定的進 料流量，反應(yīng)器內(nèi)的物系有一定的組成，對于菌體濃度而言，隨著流量的增大，菌體濃 度變小，當進料流量達到一定值時， 反應(yīng)器內(nèi)的菌體濃度可以為零， 這時稱為反應(yīng)器操 作的洗出點。 設(shè)備和試劑 1、 微生物反應(yīng)器 2、 可見分光光度計 3、 微型計量泵（蠕動泵） 4、 酒精酵母種子培養(yǎng)液 5、 葡萄糖 實驗步驟： 1、 反應(yīng)培養(yǎng)基配制： 培養(yǎng)基配方：葡萄糖 20g/L 、硫酸銨 4 g/L 、蛋白胨 5 g

24、/L 、磷酸二氫鉀 1 g/L 、 硫酸鎂 0.5 g/L 、氯化鈣 0.2 g/L 、酵母膏 1 g/L １２ 2、 反應(yīng)器反應(yīng)性能試驗： A：間歇反應(yīng)試驗： 加入一定體積的反應(yīng)培養(yǎng)基，按 10% 的接種量加入酒精酵母種子液。 30 ℃，控制 一定的攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量進行反應(yīng)。每隔半小時，取一定量的反應(yīng)液，測定其 OD 值。 B：連續(xù)反應(yīng)試驗： 在間歇反應(yīng)一定時間后， 控制反應(yīng)器內(nèi)的反應(yīng)體積在一較小值， 在間歇反應(yīng)條件下， 用蠕動泵連續(xù)加入培養(yǎng)

25、基， 并控制出料閥門， 使出料量等于進料量， 以維持反應(yīng)器內(nèi)的 液面位置不變， 這時反應(yīng)器在某一稀釋率下進行連續(xù)反應(yīng)。 當一定時間后連續(xù)反應(yīng)達到 穩(wěn)定時，取樣分析反應(yīng)液的 OD 值。調(diào)節(jié)進料流量和出料流量， 使連續(xù)反應(yīng)器在另一稀 釋率下反應(yīng)。 流量的調(diào)節(jié)是從小到大， 直至某一流量下反應(yīng)器的操作達到洗出， 完成試 驗。 分析方法： 取 5mL 反應(yīng)液，用水稀釋 50mL ，用水作為對比，在可見分光光度計上在 540nm 處測定其 OD 值。 數(shù)據(jù)記錄： 間歇實驗結(jié)果記錄表

26、 時間 0 1.0 2.0 3.0 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 Cglucose OD 間歇實驗結(jié)果記錄表 稀釋率 0.4 0.6 0.8 １３ 30min 40 min 30min 40 min 30min 40 min Cglucose OD 數(shù)據(jù)處理： 1、間歇反應(yīng)菌體濃度隨時間變化的曲線和連續(xù)反應(yīng)菌體濃度隨加料流量變化曲線，

27、 2、根據(jù)圖中數(shù)據(jù)計算： μ (1h) μ (3h) μ(6h) μmax Ks 分析和討論： 1、 間歇培養(yǎng)過程中遲滯期的長短如何調(diào)整？如何判斷連續(xù)培養(yǎng)中洗出點？ （預(yù)習時填 寫） １４ 2

28、、經(jīng)實驗數(shù)據(jù)可知，在連續(xù)培養(yǎng)過程中，什么情況下達到最佳稀釋率？洗出點的稀釋率為多少？ １５ 實驗四 停留

29、時間分布的測定 實驗?zāi)康模? 采用示蹤法測定反應(yīng)器的停留時間分布， 了解發(fā)酵罐內(nèi)流體的混合特性， 有利于發(fā) 酵罐的設(shè)計和操作。 實驗原理： 停留時間分布理論不僅是化學反應(yīng)和生化反應(yīng)工程學科的置要組成部分， 而且還廣 泛用于吸收、 萃取、蒸餾和結(jié)晶等分離過程與設(shè)備的設(shè)計及其模擬， 以及其它涉及流動 系統(tǒng)的領(lǐng)域。 對于連續(xù)反應(yīng)器， 由于流體在系統(tǒng)中流速分布的不均勻、 流體的分子擴散 和湍流擴散、攪拌引起的強制對流， 以及由于反應(yīng)器的設(shè)計加工和安裝不良而產(chǎn)生的死 區(qū)、溝流和短路等原因， 使得流體粒子在

30、系統(tǒng)中的停留時間有長有短， 有些物料過于很 快離開了反應(yīng)器，有些粒子則經(jīng)歷很長的一般時間后才離開，停留時間分布更加復(fù)雜。 物料粒子在反應(yīng)器內(nèi)的停留時間分布是一個隨機過程。 對隨機過程可用描述概率分 布的方法來描述物料粒子的停留時間分布， 即停留時間分布密度函數(shù)和停留時間分布函 １６ 數(shù)。 停留時間分布的實驗測定方法是示蹤應(yīng)答法， 用示蹤劑跟蹤流體在系統(tǒng)內(nèi)的停留時 間。根據(jù)示蹤劑加入方式的不同，可分為脈沖法、階躍法和周期輸入法。其中： 脈沖法是在設(shè)備內(nèi)流

31、體流動達到穩(wěn)定之后， 在一短的時間內(nèi)， 在系統(tǒng)入口處向流進 系統(tǒng)的流體加入一定量的示蹤劑， 同時在出口處檢測流出物料中示蹤劑濃度隨時間的變 化。對于實驗中采集的離散型數(shù)據(jù)，可采用下式進行計算停留時間分布密度函數(shù)： 階躍法是將系統(tǒng)中作穩(wěn)態(tài)流動的流體切換為流量相同的含有示蹤劑的流體， 或者相 反。前一種稱為升階法； 后一種稱為降階法。 階躍法與脈沖法的根本區(qū)別是前者連續(xù)向 系統(tǒng)加入示蹤劑，一直到實驗測定結(jié)束， 而后者則是在一段短的時間內(nèi)加入全部示蹤劑。 對于實驗中采集的離散型數(shù)據(jù)，可采用下式進行

32、計算停留時間分布函數(shù)： 儀器與試劑： 1、 微生物反應(yīng)器 2、 可見分光光度計 3、 微型計量泵（蠕動泵） 4、 羅丹明 B 溶液（ 0.01g/mL ） 實驗步驟： 一、脈沖法測定 : １７ 1、測定蠕動泵流量，確定反應(yīng)器內(nèi)溶液體積（ VR=30 V0 ）和反應(yīng)器出口流量。 2、調(diào)節(jié)反應(yīng)器出口流量，保持進出流量一致。 3、待達到穩(wěn)態(tài)后，將 0.01g/mL 的羅丹明 B 溶液

33、 1mL 迅速倒入，開始計時。 4、每隔 5min 取樣測定光密度，總共測定 2h 。 二、階躍法測定： 1、清洗反應(yīng)器后，在反應(yīng)器中加入相同量清水，開啟攪拌（ 300r/min ）。 2、調(diào)節(jié)蠕動泵，保持進出流量一致。 3、待達到穩(wěn)態(tài)后，將泵進口接到 10 -5 g/mL 的羅丹明 B 溶液中，待溶液剛滴入反應(yīng)器 時開始計時。 4、每隔 5min 取樣測定光密度，總共測定 2h 。 實驗記錄： 脈沖法 時間 5101520 25 30 35 40 45 50 55 （ min ）

34、 OD 時間 65707580 90 95 100 105 110 60 85 （ min ） OD 階躍法 時間 5101520 25 30 35 40 45 50 55 （ min ） OD 時間 65707580 90 95 100 105 110 60 85 （ min ） OD １８ 實驗結(jié)果處理與分析：

35、 繪制停留時間分布密度函數(shù)圖（脈沖法）和停留時間分布函數(shù)圖（階躍法） 通過脈沖法測定的數(shù)據(jù)計算分布密度函數(shù)、分布函數(shù)： １９ t 脈沖法 階躍法 E(t

36、) F(t) C(t) F(t) C(t) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110

37、 115 120 通過脈沖法測定的數(shù)據(jù)計算平均停留時間 t 和方差 2 ： t 脈沖法 階躍法 tC(t) t 2 C(t) C(t) tC(t) t 2 C(t) C(t) ２０ 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105

38、 110 115 120 t 2 2 分析和討論： 5、 討論分析理想反應(yīng)器的分類？如何通過測定數(shù)據(jù)計算、分析反應(yīng)器的類型？（預(yù)習 ２１ 時填寫） 6、 試分析實驗過程中使用的反應(yīng)器是否為理想反應(yīng)器， 為什么？如何能夠使得反應(yīng)器 更接近理想反應(yīng)器？ ２２