細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)

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1、附件9 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn) Bacterial Reverse Mutati on Assay 1范圍 本規(guī)范確定了細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)的基本原則、要求和方 法。 本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品的基因突變檢測(cè)。 2定義 2.1 回復(fù)突變 reverse mutation 細(xì)菌在化學(xué)致突變物作用下由營(yíng)養(yǎng)缺陷型回變到原養(yǎng)型 (prototroph)。 2.2 基因突變 gene mutation 在化學(xué)致突變物作用下細(xì)胞 DNA中堿基對(duì)的排列順序發(fā)生 變化。 2.3 堿基置換突變 base substitution mutation 引起DNA鏈上一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的置換。 堿

2、基置換有轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(transversion)兩種形式。 轉(zhuǎn)換是DNA鏈上的一個(gè)嘧啶被另一嘧啶所替代，或一個(gè)嘌 呤被另一嘌呤所代替。 顛換是DNA鏈上的一個(gè)嘧啶被另一嘌呤所替代，或一個(gè)嘌 呤被另一嘧啶所代替 2.4 移碼突變 frameshift mutation 引起DNA鏈上增加或缺失一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)。 2.5 纟田菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn) bacterial reverse mutation assay 利用一組組氨酸或者色氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株測(cè)定引起細(xì)菌 堿基置換或移碼突變的化學(xué)物質(zhì)所誘發(fā)的氨基酸缺陷型 —原養(yǎng) 型回復(fù)突變的試驗(yàn)方法。 2.6 S9 經(jīng)多

3、氯聯(lián)苯（PCB混合物）或苯巴比妥鈉和 爐萘黃酮結(jié)合誘 導(dǎo)的大鼠制備肝勻漿，在 9000g下離心10min后的肝勻漿上清 液。 3原理 鼠傷寒沙門氏組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸， 故 在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上， 僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng)； 大腸桿菌色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株不能合成色氨酸， 故在缺乏色 氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng)。 假如有致突 變物存在，則營(yíng)養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌回復(fù)突變成原養(yǎng)型，因而能生 長(zhǎng)形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。 某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復(fù)突變， 故需加入 經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠肝制備的 S9混合液。 4儀器和設(shè)備 培養(yǎng)

4、箱、恒溫水浴、振蕩水浴搖床、壓力蒸汽消毒器、干熱 烤箱、低溫冰箱（—80 C ）或液氮生物容器、普通冰箱、天平 （精密度0.1g和O.OOOIg）、混勻振蕩器、勻漿器、菌落計(jì)數(shù)器、 低溫高速離心機(jī)，玻璃器皿、生物安全柜等。 5培養(yǎng)基和試劑 5.1 0.5mmol/L 組氨酸一0.5mmol/L 色氨酸一0.5mmol/L 生物 素溶液 成分: L-組氨酸（MW155 ） 78mg D-生物素（MW244 ） 122mg L-色氨酸（MW204 ） 102mg 加蒸餾水/去離子水至 1000mL 配制： 將上述成分加熱，以溶解生物素，然

5、后在 0.068MPa 下 高壓滅菌20min。貯于4 C冰箱。若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則 不添加色氨酸。 5.2頂層瓊脂培養(yǎng)基 成分：瓊脂粉 1.2g 氯化鈉 1.0g 加蒸餾水/去離子水至 200mL 配制：上述成分混合后，于 0.103MPa下高壓滅菌30min。 實(shí)驗(yàn)時(shí)，加入 0.5mmol/L組氨酸一0.5mmol/L色氨酸一0.5mmol/L 生物素溶液20mL。若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨 酸。 5.3 Vogel-Bonner（V-B）培養(yǎng)基 E 100g 成分： 枸櫞酸26出07出0） 磷酸氫二鉀（K2HPO4） 500g 磷酸氫銨鈉（NaN

6、HqHPOq 4出0） I75g 硫酸鎂（MgSO4 7H2O） log 加蒸餾水/去離子水至 1000mL 配制：先將前三種成分加熱溶解后，再將溶解的硫酸鎂緩 緩倒入容量瓶中，加蒸餾水 /去離子水至1000mL。于0.103MPa 下高壓滅菌30min。儲(chǔ)于4C冰箱。 5.4 20%葡萄糖溶液 成分： 葡萄糖 200g 加蒸餾水/去離子水至 1000mL 配制：加少量蒸餾水/去離子水加溫溶解葡萄糖，再加蒸餾水 / 去離子水至1000mL。于0.068MPa下高壓滅菌20min。儲(chǔ)于4C 冰箱。 5.5底層瓊脂培養(yǎng)基 成分： 瓊脂粉 7.5g 蒸餾水/去離子水

7、 480mL V-B培養(yǎng)基E 10mL 20%葡萄糖溶液 10mL 配制： 首先將前兩種成分于 0.103MPa下咼壓火菌 30min 后，再加入后兩種成分，充分混勻倒底層平板。按每皿 25mL 制 備平板，冷凝固化后倒置于 37 C培養(yǎng)箱中24h,備用 5.6營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 成分： 牛肉膏 2.5g 胰胨 5.0g 磷酸氫二鉀(K2HPO4) 1.0g 加蒸餾水/去離子水至 500mL 配制：將上述成分混合后，于 0.103MPa下高壓火菌 30min。儲(chǔ)于4C冰箱。 5.7 鹽溶液(1.65mol/L KCI+0.4m

8、ol/L MgCI 2) 成分：氯化鉀(KCl) 61.5g 氯化鎂(MgCl 2 6H2O) 40.7g 加蒸餾水/去離子水至 500mL 配制：在水中溶解上述成分后，于 0.103MPa下咼壓火菌 30min。儲(chǔ)于4C冰箱。 5.8 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4) 成分： 磷酸二氫鈉(NaH2PO4 2H2O) 2.965g 磷酸氫二鈉(Na2HPO4 12H2O) 29.015g 加蒸餾水/去離子水至 500mL 配制：溶解上述成分后，于 0.103MPa 下 F咼壓火菌30min。 儲(chǔ)于4C冰箱。 5.9 S9混合液

9、 成分： 每毫升S9混合液 肝S9 鹽溶液 100 pl 20 pl 滅菌蒸餾水/去離子水 380 pl 0.2mol/L磷酸鹽緩沖液 500 p 輔酶 ll(NADP) 4 pmol 6-磷酸葡萄糖(G-6-P) 5 pmol 配制：將輔酶II和6-磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶?jī)?nèi)稱重， 然后按上述相反的次序加入各種成分，使肝 S9加到已有緩沖液 的溶液中。該混合液必須臨用現(xiàn)配， 并保存于冰水浴中。實(shí)驗(yàn)結(jié) 束，剩余S9混合液應(yīng)該丟棄。 5.10菌株鑒定用和特殊用途試劑 5.10.1組氨酸-色氨酸-生物素平板 成分：瓊脂粉 15g 蒸餾水/去離子水 934m

10、L (V-B)培養(yǎng)基 E 20mL 20%葡萄糖 20mL 滅菌鹽酸組氨酸水溶液(0.5g/100mL) 10mL 滅菌鹽酸色氨酸水溶液(0.5g/100mL) lOmL 滅菌0.5mmol/L生物素溶液 6mL 配制：高壓滅菌瓊脂和水后，將滅菌 20%葡萄糖，V-B培養(yǎng) 基、組氨酸溶液，加進(jìn)熱的瓊脂溶液中(若試驗(yàn)中不使用大腸 桿菌，則不添加色氨酸，同時(shí)蒸餾水 /去離子水改為 944mL )。 待溶液稍微冷卻后，加入滅菌生物素，混勻，澆制平板。 5.10.2氨芐青霉素平板和氨芐青霉素 /四環(huán)素平板 成分：瓊脂粉 15g 蒸餾水/去離子水 930mL (V-B)鹽溶液 2

11、0mL 20%葡萄糖 20mL 滅菌鹽酸組氨酸溶液(0.5g/100mL ) lOmL 滅菌鹽酸色氨酸水溶液(0.5g/100mL) i0mL 滅菌0.5mmol/L生物素溶液 6mL 氨芐青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/L 3.15mL NaOH 中) 四環(huán)素溶液(8mg/mL 于 0.02mol/L HCl 0.25mL 中) 配制：瓊脂和水高壓滅菌 20min，將無(wú)菌的葡萄糖、VB鹽 溶液、組氨酸溶液和色氨酸溶液，加進(jìn)熱的瓊脂溶液中， 混勻 (若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添加色氨酸，同時(shí)蒸餾水 /去 離子水改為加 940mL )。冷卻至大約50 C,無(wú)菌條

12、件下加入四 環(huán)素溶液和/或氨芐青霉素溶液。 應(yīng)該在傾注瓊脂平板后幾天內(nèi)，制備主平板。 5.10.3營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板 成分：瓊脂粉 7.5g 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 500mL 配制：于0.103MPa下高壓滅菌30min后傾注平板。 6試驗(yàn)菌株及其生物學(xué)特性鑒定 6.1試驗(yàn)菌株 采用以下菌株作為標(biāo)準(zhǔn)組合： 鼠傷寒沙門氏菌TA1535; 鼠傷寒沙門氏菌TA97或TA97a或TA1537 ; 鼠傷寒沙門氏菌TA98 ; 鼠傷寒沙門氏菌TA100 ; 鼠傷寒沙門氏菌 TA102或大腸桿菌 WP2 uvrA或大腸桿菌 WP2uvrA（ pKM101）; 6.2生物學(xué)特性鑒定 新獲得

13、的或長(zhǎng)期保存的菌種，在試驗(yàn)前必須進(jìn)行菌株的生 物特性鑒定。菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)，如表 1所示 表1試驗(yàn)菌株鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn) 組氨 酸缺 陷 色氨 酸缺 陷 脂多 氨芐 自發(fā)回變菌落參考數(shù) 菌株 糖屏 障缺 損 青霉 素抗 性 切除修復(fù) 缺損 四環(huán)素 抗性 Ames實(shí)驗(yàn)室 Zeiger實(shí)驗(yàn)室 TA97 + / + + + - 90?180* 75?200* TA97a + / + + + - 90?180* 75?200* TA98 + / + + + - 30~50 20~50 TA100 + /

14、 + + + - 100~200 75~200 TA102 + / + + - + 240?320* 100~400* TA1535 + / + - + - 10~35 5~20 TA1537 + / + - + - 3~15 5~20 WP2 uvrA / + / - + - / 5~20 WP2 uvrA （pKM101） / + / + + - / 100~200 注 “ +表 示需要 組氨酸 “ +表 示需要 色氨酸 “ +表 示具有 ■fa突變 “ +表 示具

15、有 R因子 +表示對(duì)于 鼠傷寒沙門 氏菌具有 △uvr B 突 變，對(duì)于大 腸桿菌，具 +表示 具有 pAQ1 質(zhì) 粒 *在體外代謝活化條件下自發(fā)回變菌 落數(shù)略增。 對(duì)于各菌的自發(fā)回變范圍，各個(gè)實(shí) 驗(yàn)至在參考其他頭驗(yàn)至數(shù)據(jù)的基礎(chǔ) 上應(yīng)建立自己的歷史對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)， 形成適合本實(shí)驗(yàn)室條件的適用范 有Z\uvrA突 變 圍。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室背景數(shù)據(jù)應(yīng)當(dāng)與 文獻(xiàn)報(bào)道相符。 6.2.1組氨酸缺陷/色氨酸缺陷 原理：組氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株本身不能合成組氨酸，只能 在補(bǔ)充組氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上， 則不能生長(zhǎng)。 色氨酸缺陷試驗(yàn)菌株本身不能合成

16、色氨酸，只能在補(bǔ)充色 氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而在缺乏色氨酸的培養(yǎng)基上，則不能生 長(zhǎng)。 鑒定方法：將測(cè)試菌株增菌液分別于含組氨酸或者色氨酸 培養(yǎng)基平板和無(wú)組氨酸或者色氨酸平板上劃線，于 37 C下培養(yǎng) 24h后觀察結(jié)果。 結(jié)果判斷：組氨酸缺陷型菌株在含組氨酸平板上生長(zhǎng)， 而在 無(wú)組氨酸平板上則不能生長(zhǎng)；色氨酸缺陷型菌株在含色氨酸平 板上生長(zhǎng)，而在無(wú)色氨酸平板上則不能生長(zhǎng)。 6.2.2脂多糖屏障缺損 原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一層脂多糖屏障 缺損，因此一些大分子物質(zhì) ，如結(jié)晶紫能穿透菌膜進(jìn)入菌體，從 而抑制其生長(zhǎng)，而野生型菌株則不受其影響。 鑒定方法：吸取待測(cè)菌株增菌液

17、0.1mL于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上 劃線，然后將浸濕的 0.1%結(jié)晶紫溶液濾紙條與劃線處交叉放 置。37 C下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。 結(jié)果判斷：假若待測(cè)菌在濾紙條與劃線交叉處出現(xiàn)一透明菌 帶，說(shuō)明該待測(cè)菌株具有rfa突變。 623氨芐青霉素抗性 原理：含 R因子的試驗(yàn)菌株對(duì)氨芐青霉素有抗性。因?yàn)?R 因子不太穩(wěn)定，容易丟失，故用氨芐青霉素確定該質(zhì)粒存在與 否。 鑒定方法：吸取待測(cè)菌株增菌液 0.1mL，在氨芐青霉素平 板上劃線，37C下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。 結(jié)果判斷；假若測(cè)試菌在氨芐青霉素平板上生長(zhǎng)， 說(shuō)明該測(cè) 試菌具有抗氨芐青霉素作用，表示含 R因子，否則，表示測(cè)試 菌不含R

18、因子或R因子丟失。 6.2.4紫外線敏感性 原理：具有△uvrB/A突變的菌株對(duì)紫外線敏感，當(dāng)受到紫 外線照射后，不能生長(zhǎng)，而具有野生型切除修復(fù)酶的菌株，則 能照常生長(zhǎng)。 鑒定方法：吸取待測(cè)菌株增菌液 0.1mL于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上 劃線，用黑紙蓋住平板的一半，置紫外燈下照射（ 15W，距離 33cm） 8秒鐘。置37C下孵育24h后觀察結(jié)果。 結(jié)果判斷：具有 AuvrB/A突變的菌株對(duì)紫外線敏感，經(jīng)輻 射后細(xì)菌不生長(zhǎng)，而具有完整地切除修復(fù)系統(tǒng)的菌株，則照常 生長(zhǎng)。 6.2.5四環(huán)素抗性 原理：具有pAQI的菌株對(duì)四環(huán)素有抗性。 鑒定方法：吸取待測(cè)菌株增菌液 O.ImL于氨芐青霉

19、素/四環(huán) 素平板上劃線，置 37C下孵育24h后觀察結(jié)果。 結(jié)果判斷：假若測(cè)試菌照常在氨芐青霉素 /四環(huán)素平板上生 長(zhǎng)，表明該測(cè)試菌株對(duì)氨芐青霉素和四環(huán)素兩者有抗性，具有 pAQI質(zhì)粒，否則，說(shuō)明測(cè)試菌株不含 pAQI質(zhì)粒。 626自發(fā)回變 原理：每種試驗(yàn)菌株都以一定的頻率自發(fā)地產(chǎn)生回變，稱 為自發(fā)回變。這種自發(fā)回變是每種試驗(yàn)菌株的一項(xiàng)特性。 鑒定方法：將待測(cè)菌株增菌液 O.ImL加到2mL含組氨酸-色 氨酸-生物素的頂層瓊脂培養(yǎng)基的試管內(nèi)（若試驗(yàn)中不使用大腸 桿菌，則不添加色氨酸），混勻后鋪到于底層瓊脂平板上，待 瓊脂固化后，置 37C培養(yǎng)箱中孵育48— 72h后記數(shù)每皿回變菌

20、 落數(shù)。 結(jié)果判斷：每種標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株的自發(fā)回變菌落數(shù)應(yīng)符合表 1 要求。經(jīng)體外代謝活化后的自發(fā)回變菌落數(shù)，要比直接作用下 的略高。 6.2.7回變特性-診斷性試驗(yàn) 原理：每種試驗(yàn)菌株對(duì)診斷性誘變劑回變作用的性質(zhì)以及 S9混合液的效應(yīng)不一。 鑒定方法：按照平板摻入試驗(yàn)的操作步驟進(jìn)行。將受試物 換成診斷性誘變劑。 結(jié)果判斷：標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)某些診斷性誘變劑特有的回變結(jié)果 參見(jiàn)表2 表2測(cè)試菌株的回變性 誘變劑 劑量 （回皿） S9 TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 TA153 7 WP2vrA WP2uvrA (pKM101 ) 柔毛霉

21、素 6.0 - 124 3123 47 592 / / / / 疊氮化鈉 1.5 - 76 3 3000 188 320(0.5 g) i / / / CR-191 1.0 - 1640 63 185 0 / / / / 鏈霉黑素 以工7^八、、■習(xí)、 0.25 - inh inh inh 2230 / / / / 絲裂霉素C 0.5 - inh inh inh 2772 / / / / 2,4,7-三硝 基-9-芴酮 0.20 - 8377 8244 400 16

22、/ / / / 4-硝基-O- 次苯二胺 20 - 2160 1599 798 0 / / / / 4-硝基喹啉 -N-氧化物 0.5 - 528 292 4220 287 / / 610 / 甲基磺酸甲 酯 1.0(卩)1 - 174 23 2730 6586 / / / / 敵克松 50.0 - 2688 1198 183 895 / / / / 9-氨基吖啶 50 - / / / / / 337 / / 2-氨基芴 10 + 1742 6194 3026

23、 261 / / / / 苯并（a） 茁 1.0 + 337 143 937 255 / 110(5 g) / / 2-氨基恩 20 + / / / / 380(5 g) / 300 / 注：inh表示抑菌。 7大鼠肝微粒體酶的誘導(dǎo)和 S9的制備 7.1誘導(dǎo) 選擇健康雄性成年大鼠，體重 200g左右。將多氯聯(lián)苯 （PCB混合物）溶于玉米油中，濃度為200mg/mL，按 500mg/kg體重一次腹腔注射， 5d后處死動(dòng)物，處死前禁食 12h。 也可采用苯巴比妥鈉和 伕萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)的方法進(jìn)行制 備。經(jīng)口或腹腔注射給予 8

24、0mg/kg苯巴比妥鈉和 80mg/kg爐萘 黃酮，連續(xù)3天，處死前禁食16h。 7.2 S9制備 首先，用75%酒精消毒動(dòng)物皮毛，剖開(kāi)腹部。在無(wú)菌條件 下，取出肝臟，去除肝臟的結(jié)締組織，用冰浴的 0.15mol/L氯化 鉀溶液淋洗肝臟，放入盛有 0.15mol/L氯化鉀溶液的燒杯里。按 每克肝臟加入0.15mol/L氯化鉀溶液3mL。用電動(dòng)勻漿器制成肝 勻漿，再在低溫高速離心機(jī)上，在 4 C條件下，以 9000g離心 10min，取其上清液（S9）分裝于塑料管中。每管裝 2mL — 3mL。儲(chǔ)存于液氮生物容器中或— 80C冰箱中備用。 上述全部操作均在冰水浴中和無(wú)菌條件下進(jìn)

25、行。制備肝 S9 所用一切手術(shù)器械、器皿等，均經(jīng)滅菌消毒。 S9制備后，其活 力需經(jīng)診斷性誘變劑進(jìn)行鑒定。 8溶劑的選擇 如果受試物為水溶性，可用滅菌蒸餾水 /去離子水作為溶 劑；如為脂溶性，應(yīng)選擇對(duì)試驗(yàn)菌株毒性低且無(wú)致突變性的有 機(jī)溶劑，常用的有二甲基亞砜（ DMSO ）、丙酮、95%乙醇。一 般操作中，為了減少誤差和溶劑的影響，常按每皿使用劑量用 同一溶劑配成不同的濃度，固定加入量為 100 pl。 9劑量的設(shè)計(jì) 決定受試物最咼劑量的標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)細(xì)菌的毒性及其溶解度。 自發(fā)回變數(shù)的減少，背景菌變得清晰或被處理的培養(yǎng)物細(xì)菌存 活數(shù)減少，都是毒性的標(biāo)志。 對(duì)原料而言，一般最高

26、劑量組可為 5mg/皿或5 M皿。對(duì)產(chǎn) 品而言，有殺菌作用的受試物，最高劑量可為最低抑菌濃度，無(wú) 殺菌作用的受試物，最高劑量可為原液。受試物至少應(yīng)設(shè)四個(gè) 劑量組。每個(gè)劑量均做三個(gè)平行平板。 10試驗(yàn)操作步驟 10.1增菌培養(yǎng) 取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 5mL ,加入無(wú)菌試管中，將主平板或冷 凍保存的菌株培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)， 37 C振蕩（100 次/min ）培養(yǎng)10h。該菌株培養(yǎng)物應(yīng)每毫升不少于 1-2 109活菌 數(shù)。 10.2平板摻入法 實(shí)驗(yàn)時(shí)，將含0.5mmol/L 組氨酸一0.5mmol/L 色氨酸- 0.5mmol/L生物素溶液（若試驗(yàn)中不使用大腸桿菌，則不添

27、加色 氨酸）的頂層瓊脂培養(yǎng)基 2.0mL分裝于試管中，45C水浴中保 溫，然后每管依次加入試驗(yàn)菌株增菌液 0.1mL,受試物溶液 0.1mL和磷酸鹽緩沖液 0.5mL或者S9混合液0.5mL （需代謝活 化時(shí)），充分混勻，迅速傾入底層瓊脂平板上，轉(zhuǎn)動(dòng)平板，使之 分布均勻。水平放置待冷凝固化后， 倒置于37 C培養(yǎng)箱里孵育 48— 72h。記數(shù)每皿回變菌落數(shù)。 實(shí)驗(yàn)中，除設(shè)受試物各劑量組外，還應(yīng)同時(shí)設(shè)空白對(duì)照、溶 劑對(duì)照、陽(yáng)性誘變劑對(duì)照和無(wú)菌對(duì)照。 11數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判斷 記錄受試物各劑量組、空白對(duì)照（自發(fā)回變） 、溶劑對(duì)照以 及陽(yáng)性誘變劑對(duì)照的每皿回變菌落數(shù)，并求平均值和標(biāo)準(zhǔn)差

28、。 如果受試物 TA1535、TA1537、WP2uvrA的回變菌落數(shù)是 溶劑對(duì)照回變菌落數(shù)的三倍或三倍以上，受試物TA97、 TA97a、TA98、TA100、TA102、WP2uvrA（ pKM101 ）的回變 菌落數(shù)是溶劑對(duì)照回變菌落數(shù)的二倍或二倍以上，并出現(xiàn)以下 情形之一，則該受試物判定為致突變陽(yáng)性， （1） 呈劑量-反應(yīng)關(guān)系 （2） 任何一個(gè)劑量條件下，出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)并有可重復(fù)性 受試物經(jīng)上述五個(gè)試驗(yàn)菌株測(cè)定后，只要有一個(gè)試驗(yàn)菌 株，無(wú)論在加S9或未加S9條件下為陽(yáng)性，均可報(bào)告該受試物細(xì) 菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)為致突變陽(yáng)性。如果受試物經(jīng)五個(gè)試驗(yàn)菌株檢 測(cè)后，無(wú)論加 S9和未加S9均為陰性，則可報(bào)告該受試物為致突 變陰性。