高二生物選修3 基因工程 的原理和技術(shù) 課件

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1、基因工程的基本操作步驟基因工程的基本操作步驟1、獲得目的基因、獲得目的基因2、形成重組、形成重組DNA分子分子3、將重組、將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞分子導(dǎo)入受體細(xì)胞4、篩選含有目的基因的受體細(xì)胞、篩選含有目的基因的受體細(xì)胞5、目的基因的表達(dá)、目的基因的表達(dá)一、獲得目的基因一、獲得目的基因從基因從基因文庫(kù)中文庫(kù)中尋找尋找聚合酶鏈?zhǔn)椒淳酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)（應(yīng)（PCRPCR）擴(kuò)增）擴(kuò)增化學(xué)合成法化學(xué)合成法目的基因的核苷酸序列未知目的基因的核苷酸序列未知目的基因的核苷酸序列已知目的基因的核苷酸序列已知基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)部分基因文庫(kù)部分基因文庫(kù)基因組基因組DNADNA文庫(kù)文庫(kù)cDNAcDNA文庫(kù)文庫(kù)基因組

2、基因組DNADNA文庫(kù)與文庫(kù)與cDNAcDNA文庫(kù)的比較文庫(kù)的比較u基因文庫(kù)基因文庫(kù)中不是直接保管相中不是直接保管相應(yīng)基因，而是應(yīng)基因，而是保存受體菌保存受體菌，菌，菌中含基因中含基因利用利用PCRPCR提取目的基因提取目的基因PCRPCR：是一項(xiàng)在生物：是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定體外復(fù)制特定DNADNA片段片段的核酸合成技術(shù)。的核酸合成技術(shù)。原理：原理：DNADNA雙鏈復(fù)制雙鏈復(fù)制原料：模板原料：模板DNADNA；DNADNA引物；四種脫氧核苷引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定酸；熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）；離子酶）；離子PCR的基本原理的基本原理 類似于類似于DNA的體內(nèi)復(fù)

3、制。首先待擴(kuò)增的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增DNA 模板加熱模板加熱變性變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生物與它的靶序列發(fā)生退火退火，再將溫度升高使退火引物在，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以聚合酶作用下得以延伸延伸。 這種熱變性這種熱變性-復(fù)性復(fù)性-延伸的過(guò)程就延伸的過(guò)程就是一個(gè)是一個(gè)PCR循環(huán)，循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。重復(fù)。前提前提: :已知目的基因的脫氧核苷已知目的基因的脫氧核苷酸序列酸序列方法：方法：DNADNA受熱變性解旋受熱變性

4、解旋為單鏈、冷卻后為單鏈、冷卻后DNADNA引物引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合、合、DNADNA聚合酶作用下延聚合酶作用下延伸合成互補(bǔ)鏈伸合成互補(bǔ)鏈。指數(shù)增長(zhǎng)歸納()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 201234522557294時(shí)間（min）溫度（）PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍模板DNA95PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)50引物1引物2DNA引物PCR

5、的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72第1輪結(jié)束第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72第2輪結(jié)束PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)重復(fù)30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2n n 循環(huán)次數(shù)實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x)n X 平均效率,約為0.85 n 循環(huán)次數(shù) 從基因文庫(kù)中獲取

6、從基因文庫(kù)中獲取利用利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增利用化學(xué)方法人工合成利用化學(xué)方法人工合成歸納：獲取目的基因的方法歸納：獲取目的基因的方法2構(gòu)建載體形成重組形成重組DNADNA分子分子方法：方法：同種限制酶分別同種限制酶分別切割載體和目的基因，切割載體和目的基因，再用再用DNADNA連接酶把兩者連連接酶把兩者連接。接。將將重組重組DNADNA分子分子導(dǎo)入受體細(xì)胞導(dǎo)入受體細(xì)胞 導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞補(bǔ)充歸納導(dǎo)入方法（重組（重組DNADNA分子導(dǎo)入農(nóng)桿菌，分子導(dǎo)入農(nóng)桿菌，再讓農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞）再讓農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因

7、槍法基因槍法 花粉管通道法花粉管通道法導(dǎo)入動(dòng)物的方法導(dǎo)入動(dòng)物的方法將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞 顯微注射法顯微注射法（將基因表達(dá)載體提純，用顯微儀注射到受精卵（將基因表達(dá)載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）中）導(dǎo)入微生物導(dǎo)入微生物將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞4檢測(cè)和鑒定Ca2處理處理受體細(xì)胞成受體細(xì)胞成為感受態(tài)細(xì)為感受態(tài)細(xì)胞，再進(jìn)行胞，再進(jìn)行混合。混合。篩選含有目的基因的受體細(xì)胞篩選含有目的基因的受體細(xì)胞目的基因的表達(dá)目的基因的表達(dá) 檢測(cè)檢測(cè): : 是否插入目的基因是否插入目的基因 是否轉(zhuǎn)錄是否轉(zhuǎn)錄 是否翻譯是否翻譯 鑒定鑒定: : 功能活性鑒定功能活性鑒定

8、抗性鑒定抗性鑒定分別提取什么進(jìn)行檢測(cè)DNA附著在膜上附著在膜上硝化纖維素硝化纖維素加探針加探針報(bào)告基因（含熒光素分子）報(bào)告基因（含熒光素分子）變性變性DNA雜交雜交（如檢測(cè)（如檢測(cè)SARS病毒等）病毒等）abcd檢測(cè)是否插入目的基因，檢測(cè)是否插入目的基因，利用利用DNADNA分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)，目的基因，目的基因DNADNA一條鏈（作探針）與受體細(xì)胞中提取的一條鏈（作探針）與受體細(xì)胞中提取的DNADNA雜交，看是否有雜交，看是否有雜交帶。雜交帶。檢測(cè)是否轉(zhuǎn)錄出了檢測(cè)是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAmRNA，利用利用DNADNA分子雜交技術(shù)，分子雜交技術(shù)，目的基因目的基因DNADNA一條鏈（作探針）與

9、受體細(xì)胞中提取的一條鏈（作探針）與受體細(xì)胞中提取的mRNAmRNA雜交，看是否有雜交，看是否有雜交帶。雜交帶。檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)。檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)?？贵w與蛋白質(zhì)進(jìn)行抗原抗體與蛋白質(zhì)進(jìn)行抗原抗體雜交，看是否有雜交帶?？贵w雜交，看是否有雜交帶。還可以進(jìn)行個(gè)體水平的鑒定，根據(jù)其性狀。還可以進(jìn)行個(gè)體水平的鑒定，根據(jù)其性狀。提示：提示：DNADNA分子雜交技術(shù)首先提取受體細(xì)胞中的分子雜交技術(shù)首先提取受體細(xì)胞中的DNADNA，然后高，然后高溫解成單鏈，再與同位素標(biāo)記的溫解成單鏈，再與同位素標(biāo)記的DNADNA探針雜交；抗原抗體雜探針雜交；抗原抗體雜交所用到的抗體是用表達(dá)出的蛋白質(zhì)注射動(dòng)

10、物進(jìn)行免疫，產(chǎn)生交所用到的抗體是用表達(dá)出的蛋白質(zhì)注射動(dòng)物進(jìn)行免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并提取出而來(lái)的。相應(yīng)的抗體，并提取出而來(lái)的。3232（8 8分）將動(dòng)物致病菌的抗原基因?qū)腭R鈴薯制成植物疫苗，分）將動(dòng)物致病菌的抗原基因?qū)腭R鈴薯制成植物疫苗，飼喂轉(zhuǎn)基因馬鈴薯可使動(dòng)物獲得免疫力。以下是與植物疫苗制備飼喂轉(zhuǎn)基因馬鈴薯可使動(dòng)物獲得免疫力。以下是與植物疫苗制備過(guò)程相關(guān)的圖和表。過(guò)程相關(guān)的圖和表。(08(08江蘇江蘇) ) 請(qǐng)根據(jù)以上圖表回答下列問(wèn)題。請(qǐng)根據(jù)以上圖表回答下列問(wèn)題。（1）在采用常規(guī)）在采用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增目的基因的過(guò)程中，使用的方法擴(kuò)增目的基因的過(guò)程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物體

11、內(nèi)的聚合酶不同于一般生物體內(nèi)的DNA聚合酶，其最主要聚合酶，其最主要的特點(diǎn)是的特點(diǎn)是 。（2）PCR過(guò)程中退火（復(fù)性）溫度必須根據(jù)引物的堿基數(shù)過(guò)程中退火（復(fù)性）溫度必須根據(jù)引物的堿基數(shù)量和種類來(lái)設(shè)定。表量和種類來(lái)設(shè)定。表1為根據(jù)模板設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物序列，圖為根據(jù)模板設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物序列，圖2為引物對(duì)與模板結(jié)合示意圖。請(qǐng)判斷哪一對(duì)引物可采用較高為引物對(duì)與模板結(jié)合示意圖。請(qǐng)判斷哪一對(duì)引物可采用較高的退火溫度？的退火溫度？_。（3）圖）圖1步驟所用的步驟所用的DNA連接酶對(duì)所連接的連接酶對(duì)所連接的DNA兩端堿兩端堿基序列是否有專一性要求？基序列是否有專一性要求？ 。（4）為將外源基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯，圖）為將外源基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯，圖1步驟轉(zhuǎn)基因所用的步驟轉(zhuǎn)基因所用的細(xì)菌細(xì)菌B通常為通常為 。耐高溫耐高溫引物對(duì)引物對(duì)B否否農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌（5）對(duì)符合設(shè)計(jì)要求的重組質(zhì)粒）對(duì)符合設(shè)計(jì)要求的重組質(zhì)粒T進(jìn)行酶切，。假設(shè)所用的酶進(jìn)行酶切，。假設(shè)所用的酶均可將識(shí)別位點(diǎn)完全切開，請(qǐng)根據(jù)圖均可將識(shí)別位點(diǎn)完全切開，請(qǐng)根據(jù)圖1中標(biāo)示的酶切位點(diǎn)和表中標(biāo)示的酶切位點(diǎn)和表2所列的識(shí)別序列，對(duì)以下酶切結(jié)果作出判斷。所列的識(shí)別序列，對(duì)以下酶切結(jié)果作出判斷。采用采用EcoR和和Pst酶切，得到酶切，得到_種種DNA片斷。片斷。采用采用EcoR和和Sma酶切，得到酶切，得到_種種DNA片斷。片斷。21