漁業(yè)養(yǎng)殖用水中喹諾酮類抗生素測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

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ICS?65.150 B 51 ????? DB32 江蘇地方標(biāo)準(zhǔn) DB32/T XXXX—2020 ????? 漁業(yè)養(yǎng)殖用水中喹諾酮類抗生素測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 Determination of quinolones in aquaculture water by LC-MS/MS ????? 2020 - XX - XX發(fā)布 2020 - XX - XX實(shí)施 江蘇省市場(chǎng)監(jiān)督管理局???發(fā)布 DB32/T XXXX—2020 前??言 本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1—2009給出的規(guī)則起草。 本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。 本標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省漁業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。 本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：江蘇省淡水水產(chǎn)研究所、江蘇省水產(chǎn)質(zhì)量檢測(cè)中心。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：孟勇、沈美芳、朱曉華、楊洪生、王靜、張美琴、譚秀慧、劉崇萬(wàn)、王凱、朱凜。 7 漁業(yè)養(yǎng)殖用水中喹諾酮類抗生素測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 1　 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了漁業(yè)養(yǎng)殖用水中16種喹諾酮類抗生素殘留量的前處理和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于漁業(yè)養(yǎng)殖用水中恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、依諾沙星、洛美沙星、萘啶酸、惡喹酸、氟甲喹、丹諾沙星、雙氟沙星、奧比沙星、司帕沙星、氟羅沙星16種抗生素殘留量的測(cè)定。 2　 規(guī)范性引用文件 下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其有效版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。 3 原理 水樣用混合纖維素濾膜過(guò)濾后，喹諾酮類抗生素經(jīng)固相萃取柱富集、洗脫和凈化后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。 4 試劑和材料 4.1 甲醇（CH3OH）。 4.2 乙腈（CH3CN）。 4.3 甲酸（HCOOH）。 4.4 乙酸銨（CH3COONH4）。 4.5 氨水（NH3H2O）：優(yōu)級(jí)純。 4.6 5 mmol/L乙酸銨緩沖液：稱取0.1925 g乙酸銨（4.4），溶于500 mL水中。用甲酸（4.3）調(diào)節(jié)pH為30.05。 4.7 5%氨水甲醇溶液：量取5 mL氨水（4.5），用甲醇稀釋并定容至100 mL。 4.8 0.1%甲酸水溶液：量取1mL甲酸（4.3），用水稀釋至1000 mL。 4.9 0.1%甲酸水-乙腈：（9+1，體積比），量取90mL0.1%甲酸水溶液（4.8）和10mL乙腈（4.2）混合。 4.10 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：恩諾沙星（Enrofloxacin）、諾氟沙星（Norfloxacin）、培氟沙星（Pefloxacin）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin）、氧氟沙星（Ofloxacin）、沙拉沙星（Sarafloxacin）、依諾沙星（Enoxacin）、洛美沙星（Lomefloxacin）、萘啶酸（Nalidixic acid）、惡喹酸（Oxolinic acid）、氟甲喹（Flumequine）、丹諾沙星（Danafloxacin）、雙氟沙星（Difloxacin）、奧比沙星（Orbifloxacin）、司帕沙星（Sparfloxacin）、氟羅沙星（Fleroxacin），純度≥97.0%。 4.11 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)：氘代諾氟沙星，氘代環(huán)丙沙星、氘代恩諾沙星，純度≥97.0%。 4.12 喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取適量喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品（4.10），用甲醇(4.1)溶解并定容至10mL，使各種喹諾酮的濃度均為1.0 mg/mL。-18℃以下避光保存，有效期6個(gè)月。 4.13 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取適量?jī)?nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品（4.11），用甲醇(4.1)溶解并定容至10mL，使各種內(nèi)標(biāo)濃度均為1.0 mg/mL。-18℃以下避光保存，有效期6個(gè)月。 4.14 混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：分別量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(4.12)于100mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋配制成濃度為1 g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。-18℃以下避光保存，有效期3個(gè)月。 4.15 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)需要用0.1%甲酸水-乙腈（4.9）由混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（4.14）稀釋成合適的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。 4.16 混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(4.13)于100mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋配制成濃度為1 g/mL的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。-18℃以下避光保存，有效期3個(gè)月。 注：除另有說(shuō)明外，以下所用的試劑均為色譜純，試驗(yàn)用水為GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水。 5 儀器和設(shè)備 5.1 液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源(ESI)。 5.2 天平：感量0.01 g。 5.3 分析天平：感量0.00001 g。 5.4 渦旋混合器。 5.5 氮吹儀。 5.6 pH計(jì)：測(cè)量精度0.05。 5.7 刻度玻璃離心管：10 mL。 5.8 混合纖維素濾膜：0.45 m。 5.9 水系濾膜：0.22 m。 5.10 固相萃取柱：HLB固相萃取柱：500 mg，6 mL，或性能相當(dāng)者。 5.11 固相萃取裝置。 6 樣品制備與保存 采集的漁業(yè)養(yǎng)殖水樣經(jīng)0.45 m混合纖維素濾膜過(guò)濾。如水樣較渾濁，可更換濾膜或過(guò)濾2次。過(guò)濾后的水樣于4℃密封保存，24 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。 ——取過(guò)濾后的供試樣品，作為供試試料。 ——取過(guò)濾后的空白樣品，作為空白試料。 ——取過(guò)濾后的空白樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作為空白添加試料。 7 測(cè)定步驟 7.1 提取和凈化 依次用6 mL甲醇，6 mL超純水，6 mL 5 mmol/L乙酸銨緩沖液（4.6）活化小柱（5.10）。量取200 mL過(guò)濾后的試樣，加入適量甲酸調(diào)節(jié)水樣pH為3.00.05，準(zhǔn)確加入1g/mL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液50 L（4.16）。然后以約3~5 mL/min流速通過(guò)固相萃取柱（5.10）。過(guò)柱后用6 mL超純水淋洗，再將小柱于氮?dú)獗Ｗo(hù)下干燥20 min，最后用6 mL5%氨水甲醇溶液（4.7）分兩次進(jìn)行洗脫。洗脫液于40℃水浴用氮?dú)獯抵两桑?.1%甲酸水-乙腈（4.9）定容至1 mL，渦旋混勻1 min，過(guò)0.22 m水系濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。 7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精確量取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(4.14)和適量1 g/mL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液（4.16），用0.1%甲酸水-乙腈（4.9）配制成同位素內(nèi)標(biāo)濃度為50 ng/mL以及16種喹諾酮濃度為1、5、10、20、50、100和200 ng/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。以被測(cè)組分和相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。 7.3 測(cè)定 7.3.1 色譜參考條件 液相色譜參考條件如下： a) 色譜柱：EC-C18柱，(2.1 mm x100 mm，2.7 m)，或性能相當(dāng)者。 b) 流速：0.40 mL/min。 c) 柱溫：30℃。 d) 進(jìn)樣量：10 L。 e) A為0.1%甲酸水溶液 (4.8)，B為乙腈(4.2)；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。 表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序 時(shí)間/min A相/% B相/% 0.00 95 5 2.00 85 15 10.00 45 55 12.00 10 90 13.00 95 5 15.00 95 5 7.3.2 質(zhì)譜參考條件 質(zhì)譜參考條件如下： a) 離子化模式：電噴霧離子源(ESI)，正離子模式； b) 噴霧電壓：5500 v； c) 氣簾氣流量：2L/min； d) 霧化氣流量：8 L/min； e) 輔助加熱氣流量：8 L/min； f) 離子源溫度：500℃； g) 掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，掃描參數(shù)見(jiàn)附錄A； 7.3.3 定性測(cè)定 在同樣測(cè)試條件下，試樣溶液中各抗生素的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間相對(duì)偏差在2.5%以內(nèi)，且檢測(cè)到的定性離子的相對(duì)豐度，應(yīng)與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液中定性離子的相對(duì)豐度一致?；迮c次強(qiáng)碎片離子豐度比應(yīng)符合表2要求。各抗生素的保留時(shí)間參考附錄 B。 表2 基峰與次強(qiáng)碎片離子豐度比要求 次強(qiáng)碎片離子相對(duì)豐度 % ＞50 ＞20～50 ＞10～20 ≤10 允許相對(duì)偏差 % 20 25 30 50 7.3.4 定量測(cè)定 將標(biāo)準(zhǔn)工作液和試樣溶液等體積進(jìn)樣測(cè)定，按內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，在樣品中加入回收率指示物，以此來(lái)保證整個(gè)樣品前處理過(guò)程的回收率。諾氟沙星、依諾沙星以氘代諾氟沙星為內(nèi)標(biāo)，環(huán)丙沙星、洛美沙星以氘代環(huán)丙沙星為內(nèi)標(biāo)，恩諾沙星、氧氟沙星、培氟沙星、丹諾沙星、沙拉沙星、司帕沙星、雙氟沙星、惡喹酸、氟甲喹、萘啶酸、氟羅沙星、奧比沙星以氘代恩諾沙星為內(nèi)標(biāo)。 7.3.5 空白試驗(yàn) 除不加試樣外，均按上述測(cè)定條件和步驟進(jìn)行。 8 結(jié)果計(jì)算 試樣中喹諾酮類抗生素含量按公式(1)計(jì)算，計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。 ………………………………………………………（1） 式中： Xi — 試樣中喹諾酮類抗生素含量，單位為納克每升(ng/L)； ci — 試樣溶液中喹諾酮類抗生素的濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)； V1 — 試樣溶液最終體積，單位為毫升(mL)； m — 試樣體積，單位為升(L)。 9 方法靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度 9.1 靈敏度 本方法的定量限為10 ng/L。 9.2 準(zhǔn)確度 本方法回收率范圍為70%～120%。 9.3 精密度 本方法的批內(nèi)變異系數(shù)≤15%，批間變異系數(shù)≤15%。 附 錄 A （資料性附錄） 掃描參數(shù) 表A.1 16種喹諾酮類抗生素及內(nèi)標(biāo)物的母離子、子離子和碰撞能量 序號(hào) 化合物 母離子/(m/z) 子離子/(m/z) 碰撞能量/V 1 恩諾沙星 360 245 38 316* 26 2 諾氟沙星 320 233 35 276* 26 3 培氟沙星 334 290 27 316* 30 4 環(huán)丙沙星 332 245 32 288* 26 5 氧氟沙星 362 261 26 318* 38 6 沙拉沙星 386 299 36 342* 26 7 依諾沙星 321 232 44 303* 30 8 洛美沙星 352 265 33 308* 28 9 萘啶酸 233.3 215.2 28 187.4* 44 10 惡喹酸 262 216 39 244* 26 11 氟甲喹 262 202 25 244* 40 12 丹諾沙星 358 283 30 340* 24 13 雙氟沙星 400 299 38 356* 30 14 奧比沙星 396 295 35 352* 26 15 司帕沙星 393 292 35 349* 27 16 氟羅沙星 370 269 37 326* 27 17 氘代諾氟沙星 325 307 30 18 氘代環(huán)丙沙星 340 322 28 19 氘代恩諾沙星 365 321 29 注：*為定量離子 附 錄 B （資料性附錄） 標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜色譜圖和參考保留時(shí)間 圖B.1 16種喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜XIC色譜圖 圖B.2 16種喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜TIC色譜圖 表B.1 16種喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液參考保留時(shí)間 化合物名稱 保留時(shí)間/min 化合物名稱 保留時(shí)間/min 依諾沙星 3.51 恩諾沙星 4.14 諾氟沙星 3.71 奧比沙星 4.25 氧氟沙星 3.72 沙拉沙星 4.75 氟羅沙星 3.76 司帕沙星 4.77 培氟沙星 3.78 雙氟沙星 4.84 環(huán)丙沙星 3.82 惡喹酸 5.85 丹諾沙星 3.93 萘啶酸 7.40 洛美沙星 3.96 氟甲喹 7.99 _________________________________