高中生物選修一生物技術(shù)實(shí)踐 知識(shí)點(diǎn)總結(jié).doc
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高中生物選修一生物技術(shù)實(shí)踐 知識(shí)點(diǎn)總結(jié) 妥玉寶 專題一 傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用 課題一 果酒和果醋的制作 1、發(fā)酵:通過微生物技術(shù)的培養(yǎng)來生產(chǎn)大量代謝產(chǎn)物的過程。 2、有氧發(fā)酵:醋酸發(fā)酵 谷氨酸發(fā)酵 ·無(wú)氧發(fā)酵:酒精發(fā)酵 乳酸發(fā)酵 3、酵母菌是兼性厭氧菌型微生物真菌 ·酵母菌的生殖方式:出芽生殖(主要) 分裂生殖 孢子生殖 4、在有氧條件下,酵母菌進(jìn)行有氧呼吸,大量繁殖。 C6H12O6+6O2+6H2O→6CO2+12H2O+能量 5、在無(wú)氧條件下,酵母菌能進(jìn)行酒精發(fā)酵。 C6H12O6→2C2H5OH+2CO2+能量 6、20℃左右最適宜酵母菌繁殖 酒精發(fā)酵時(shí)一般將溫度控制在18℃-25℃ 7、在葡萄酒自然發(fā)酵的過程中,起主要作用的是附著在葡萄皮表面的野生型酵母菌.在發(fā)酵過程中,隨著酒精濃度的提高,紅葡萄皮的色素也進(jìn)入發(fā)酵液,使葡萄酒呈現(xiàn)深紅色.在缺氧 呈酸性的發(fā)酵液中,酵母菌可以生長(zhǎng)繁殖,而絕大多數(shù)其他微生物都因無(wú)法適應(yīng)這一環(huán)境而受到制約。 8、醋酸菌是單細(xì)胞細(xì)菌(原核生物),代謝類型是異養(yǎng)需氧型,生殖方式為二分裂 9、當(dāng)氧氣、糖源都充足時(shí),醋酸菌將葡萄汁中的糖分解成醋酸;當(dāng)缺少糖源時(shí),醋酸菌將乙醇變?yōu)橐胰?,再將乙醛變?yōu)榇姿帷? C6H12O6+2O2→2CH3COOH+2CO2+2H2O C2H5OH+O2→CH3COOH+H2O 10、控制發(fā)酵條件的作用①醋酸菌對(duì)氧氣的含量特別敏感,當(dāng)進(jìn)行深層發(fā)酵時(shí),即使只是短時(shí)間中斷通入氧氣,也會(huì)引起醋酸菌死亡。②醋酸菌最適生長(zhǎng)溫度為32℃,控制好發(fā)酵溫度,使發(fā)酵時(shí)間縮短,又減少雜菌污染的機(jī)會(huì)。③有兩條途徑生成醋酸:直接氧化和以酒精為底物的氧化。 11、實(shí)驗(yàn)流程:挑選葡萄→沖洗→榨汁→酒精發(fā)酵→果酒(→醋酸發(fā)酵→果醋) 12、酒精檢驗(yàn):果汁發(fā)酵后是否有酒精產(chǎn)生,可以用重鉻酸鉀來檢驗(yàn)。在酸性條件下,重鉻酸鉀與酒精反應(yīng)呈現(xiàn)灰綠色。先在試管中加入發(fā)酵液2mL,再滴入物質(zhì)的量濃度為3mol/L的H2SO43滴,振蕩混勻,最后滴加常溫下飽和的重鉻酸鉀溶液3滴,振蕩試管,觀察顏色 13、充氣口是在醋酸發(fā)酵時(shí)連接充氣泵進(jìn)行充氣用的;排氣口是在酒精發(fā)酵時(shí)用來排出二氧化碳的;出料口是用來取樣的。排氣口要通過一個(gè)長(zhǎng)而彎曲的膠管與瓶身相連接,其目的是防止空氣中微生物的污染。開口向下的目的是有利于二氧化碳的排出。使用該裝置制酒時(shí),應(yīng)該關(guān)閉充氣口;制醋時(shí),應(yīng)該充氣口連接氣泵,輸入氧氣。 疑難解答 (1)你認(rèn)為應(yīng)該先沖洗葡萄還是先除去枝梗?為什么? 應(yīng)該先沖洗,然后再除去枝梗,以避免除去枝梗時(shí)引起葡萄破損,增加被雜菌污染的機(jī)會(huì)。 (2)你認(rèn)為應(yīng)該從哪些方面防止發(fā)酵液被污染? 如:要先沖洗葡萄,再除去枝梗;榨汁機(jī)、發(fā)酵裝置要清洗干凈,并進(jìn)行酒精消毒;每次排氣時(shí)只需擰松瓶蓋,不要完全揭開瓶蓋等。 (3)制葡萄酒時(shí),為什么要將溫度控制在18~25℃?制葡萄醋時(shí),為什么要將溫度控制在30~35℃? 溫度是酵母菌生長(zhǎng)和發(fā)酵的重要條件。20℃左右最適合酵母菌的繁殖。因此需要將溫度控制在其最適溫度范圍內(nèi)。而醋酸菌是嗜溫菌,最適生長(zhǎng)溫度為32℃,因此要將溫度控制在30~35℃。 課題二 腐乳的制作 1、多種微生物參與了豆腐的發(fā)酵,如青霉、酵母、曲霉、毛霉等,其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一種絲狀真菌。代謝類型是異養(yǎng)需氧型。生殖方式是孢子生殖。營(yíng)腐生生活。 2、原理:毛霉等微生物產(chǎn)生的蛋白酶能將豆腐中的蛋白質(zhì)分解成小分子的肽和氨基酸;脂肪酶可將脂肪水解為甘油和脂肪酸。 3、實(shí)驗(yàn)流程:讓豆腐上長(zhǎng)出毛霉→加鹽腌制→加鹵湯裝瓶→密封腌制 4、釀造腐乳的主要生產(chǎn)工序是將豆腐進(jìn)行前期發(fā)酵和后期發(fā)酵。 前期發(fā)酵的主要作用:1.創(chuàng)造條件讓毛霉生長(zhǎng)。2.使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。 后期發(fā)酵主要是酶與微生物協(xié)同參與生化反應(yīng)的過程。通過各種輔料與酶的緩解作用,生成腐乳的香氣。 5、將豆腐切成3cm×3cm×1cm的若干塊。所用豆腐的含水量為70%左右,水分過多則腐乳不易成形。*水分測(cè)定方法如下:精確稱取經(jīng)研缽研磨成糊狀的樣品5~10g(精確到0.02mg),置于已知重量的蒸發(fā)皿中,均勻攤平后,在100~105℃電熱干燥箱內(nèi)干燥4h,取出后置于干燥器內(nèi)冷卻至室溫后稱重,然后再烘30min,直至所稱重量不變?yōu)橹埂? 樣品水分含量(%)計(jì)算公式如下: (烘干前容器和樣品質(zhì)量-烘干后容器和樣品質(zhì)量)/烘干前樣品質(zhì)量 ·毛霉的生長(zhǎng):條件:將豆腐塊平放在籠屜內(nèi),將籠屜中的控制在15~18℃,并保持一定的濕度。 來源:1.來自空氣中的毛霉孢子,2. 直接接種優(yōu)良毛霉菌種 時(shí)間:5天 ·加鹽腌制:將長(zhǎng)滿毛霉的豆腐塊分層整齊地?cái)[放在瓶中,同時(shí)逐層加鹽,隨著層數(shù)的加高而增加鹽量,接近瓶口表面的鹽要鋪厚一些。加鹽腌制的時(shí)間約為8天左右。 ·用鹽腌制時(shí),注意控制鹽的用量:鹽的濃度過低,不足以抑制微生物的生長(zhǎng),可能導(dǎo)致豆腐腐敗變質(zhì);鹽的濃度過高會(huì)影響腐乳的口味 ·食鹽的作用:1.抑制微生物的生長(zhǎng),避免腐敗變質(zhì)2.析出水分,使豆腐變硬,在后期制作過程中不易酥爛3.調(diào)味作用,給腐乳以必要的咸味4.浸提毛酶菌絲上的蛋白酶。 ·配制鹵湯:鹵湯直接關(guān)系到腐乳的色、香、味。鹵湯是由酒及各種香辛料配制而成的。鹵湯中酒的含量一般控制在12%左右。 ·酒的作用:1.防止雜菌污染以防腐2.與有機(jī)酸結(jié)合形成酯,賦予腐乳風(fēng)味3.酒精含量的高低與腐乳后期發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短有很大關(guān)系,酒精含量越高,對(duì)蛋白酶的抑制作用也越大,使腐乳成熟期延長(zhǎng);酒精含量過低,蛋白酶的活性高,加快蛋白質(zhì)的水解,雜菌繁殖快,豆腐易腐敗,難以成塊。 ·香辛料的作用:1.調(diào)味作用2.殺菌防腐作用3.參與并促進(jìn)發(fā)酵過程 ·防止雜菌污染:①用來腌制腐乳的玻璃瓶,洗刷干凈后要用沸水消毒。②裝瓶時(shí),操作要迅速小心。整齊地?cái)[放好豆腐、加入鹵湯后,要用膠條將瓶口密封。封瓶時(shí),最好將瓶口通過酒精燈的火焰,防止瓶口被污染。 疑難解答 (1)利用所學(xué)的生物學(xué)知識(shí),解釋豆腐長(zhǎng)白毛是怎么一回事? 豆腐生長(zhǎng)的白毛是毛霉的白色菌絲。嚴(yán)格地說是直立菌絲,在豆腐中還有匍匐菌絲。 (2)為什么要撒許多鹽,將長(zhǎng)毛的豆腐腌起來? 鹽能防止雜菌污染,避免豆腐腐敗。 (3)我們平常吃的豆腐,哪種適合用來做腐乳? 含水量為70%左右的豆腐適于作腐乳。用含水量高的豆腐制作腐乳,不易成形。 (4)吃腐乳時(shí),你會(huì)發(fā)現(xiàn)腐乳外部有一層致密的“皮”。這層“皮”是怎樣形成的呢?它對(duì)人體有害嗎?它的作用是什么? “皮”是前期發(fā)酵時(shí)在豆腐表面上生長(zhǎng)的菌絲(匍匐菌絲),對(duì)人體無(wú)害。它能形成腐乳的“體”,使腐乳成形。 課題三 制作泡菜 ·制作泡菜所用微生物是乳酸菌 ,其代謝類型是異養(yǎng)厭氧型。在無(wú)氧條件下,將糖分解為乳酸 。分裂方式是二分裂。反應(yīng)式為:C6H12O6 2C3H6O3+能量 含抗生素牛奶不能生產(chǎn)酸奶的原因是抗生素殺死乳酸菌。常見的乳酸菌有乳酸鏈球菌和乳酸桿菌。乳酸桿菌常用于生產(chǎn)酸奶。 ·亞硝酸鹽為白色粉末,易溶于水,在食品生產(chǎn)中用作食品添加劑。 ·膳食中的亞硝酸鹽一般不會(huì)危害人體健康,國(guó)家規(guī)定肉制品中不超過30mg/kg,醬腌菜中不超過20mg/kg,嬰兒奶粉中不超過2mg/kg。亞硝酸鹽被吸收后隨尿液排出體外,但在適宜pH 、溫度和一定微生物作用下形成致癌物質(zhì)亞硝胺。 亞硝酸鹽含量 發(fā)酵時(shí)間(d) ·一般在腌制 10 天后亞硝酸鹽含量開始降低,故在10天之后食用最好 測(cè)定亞硝酸鹽含量的方法是:比色法 原理是在鹽酸酸化條件下,亞硝酸鹽與對(duì)基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)后,與 N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽結(jié)合形成玫瑰紅色染料,與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)顯色液目測(cè)比較,估算泡菜中亞硝酸鹽含量。 專題二 微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用 課題一 微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng) ·培養(yǎng)基:人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求,配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì),是進(jìn)行微生物培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。 ·培養(yǎng)基按照物理性質(zhì)可分為液體培養(yǎng)基 半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基中加入凝固劑瓊脂(是從紅藻中提取的一種多糖,在配制培養(yǎng)基中用作凝固劑)后,制成瓊脂固體培養(yǎng)基。微生物在固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng),可以形成肉眼可見的菌落。根據(jù)菌落的特征可以判斷是哪一種菌。液體培養(yǎng)基應(yīng)用于工業(yè)或生活生產(chǎn),固體培養(yǎng)基應(yīng)用于微生物的分離和鑒定,半固體培養(yǎng)基則常用于觀察微生物的運(yùn)動(dòng)及菌種保藏等。 ·按照成分培養(yǎng)基可分為人工合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基是用成分已知的化學(xué)物質(zhì)配制而成,其中成分的種類比例明確,常用于微生物的分離鑒定。天然培養(yǎng)基是用化學(xué)成分不明的天然物質(zhì)配制而成,常用于實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)。 ·按照培養(yǎng)基的用途,可將培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基和鑒定培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基是指在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì),以抑制不需要的微生物生長(zhǎng),促進(jìn)所需要的微生物的生長(zhǎng)。鑒別培養(yǎng)基是根據(jù)微生物的特點(diǎn),在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成的,用以鑒別不同類別的微生物。 ·培養(yǎng)基的化學(xué)成分包括 水 、 無(wú)機(jī)鹽 、 碳源 、 氮源 (生長(zhǎng)因子)等。 ·碳源:能為微生物的代謝提供碳元素的物質(zhì)。如CO2、NaHCO3等無(wú)機(jī)碳源;糖類、石油、花生粉餅等有機(jī)碳源。異養(yǎng)微生物只能利用有機(jī)碳源。單質(zhì)碳不能作為碳源。 ·氮源:能為微生物的代謝提供氮元素的物質(zhì)。如N2、NH3、NO3-、NH4+(無(wú)機(jī)氮源)蛋白質(zhì)、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨(有機(jī)氮源)等。只有固氮微生物才能利用N2。 ·培養(yǎng)基還要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)PH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。例如,培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)需要在培養(yǎng)基中添加維生素,培養(yǎng)霉菌時(shí)須將培養(yǎng)基的pH調(diào)至酸性,培養(yǎng)細(xì)菌是需要將pH調(diào)至中性或微堿性,培養(yǎng)厭氧型微生物是則需要提供無(wú)氧的條件 ·無(wú)菌技術(shù)·獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來雜菌的入侵,要注意以下幾個(gè)方面: ①對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手,進(jìn)行清潔和消毒。 ②將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌。 ③為避免周圍環(huán)境中微生物的污染,實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。 ④實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。 無(wú)菌技術(shù)除了用來防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外,還有什么目的? 答:無(wú)菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。 ·消毒與滅菌的區(qū)別 消毒指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物(不包括芽孢和孢子)。消毒方法常用煮沸消毒法,巴氏消毒法(對(duì)于一些不耐高溫的液體)還有化學(xué)藥劑(如酒精、氯氣、石炭酸等)消毒、紫外線消毒。 滅菌則是指使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物,包括芽孢和孢子。滅菌方法有灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。 滅菌方法: ①接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法; ②玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法,所用器械是干熱滅菌箱 ; ③培養(yǎng)基、無(wú)菌水等使用高壓蒸汽滅菌法,所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋 。 ④表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法,所用器械是紫外燈 。 比較項(xiàng) 理化因素的作用強(qiáng)度 消滅微生物的數(shù)量 芽孢和孢子能否被消滅 消毒 較為溫和 部分生活狀態(tài)的微生物 不能 滅菌 強(qiáng)烈 全部微生物 能 制作牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基 (1)方法步驟:計(jì)算、稱量、溶化、滅菌、倒平板。 (2)倒平板操作的步驟: ①將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上,右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶,左手拔出棉塞。 ②右手拿錐形瓶,將瓶口迅速通過火焰。 ③用左手的拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙,右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基(約10~20mL)倒入培養(yǎng)皿,左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。 ④等待平板冷卻凝固,大約需5~10min。然后,將平板倒過來放置,使培養(yǎng)皿蓋在下、皿底在上。 ·倒平板操作的討論 1.培養(yǎng)基滅菌后,需要冷卻到50℃左右時(shí),才能用來倒平板。你用什么辦法來估計(jì)培養(yǎng)基的溫度? 提示:可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶,感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí),就可以進(jìn)行倒平板了。 2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰? 答:通過灼燒滅菌,防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。 3.平板冷凝后,為什么要將平板倒置? 答:平板冷凝后,皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠,將平板倒置,既可以防止培養(yǎng)基表面的水分過度地?fù)]發(fā),又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基,造成污染。 4.在倒平板的過程中,如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位,這個(gè)平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎?為什么? 答:空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生,因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。 純化大腸桿菌 (1)微生物接種的方法最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。 (2)平板劃線法是通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作。將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng),可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的子細(xì)胞群體,這就是菌落。 (3)稀釋涂布平板法是將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋,然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面,進(jìn)行培養(yǎng)。分為系列稀釋操作和涂布平板操作兩步。 (4)用平板劃線法和稀釋涂布平板法接種的目的是:使聚集在一起的微生物分散成單個(gè)細(xì)胞,從而能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)的菌落,以便于純化菌種。 (5)平板劃線法操作步驟: ①將接種環(huán)放在火焰上灼燒,直到接種環(huán)燒紅。②在火焰旁冷卻接種環(huán),并打開棉塞。 ③將試管口通過火焰。④將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液。 ⑤將試管通過火焰,并塞上棉塞。⑥左手將皿蓋打開一條縫隙,右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi),劃三至五條平行線,蓋上皿蓋。注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)皿。⑦灼燒接種環(huán),待其冷卻后,從第一區(qū)域劃線的末端開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作,在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。⑧將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 ·平板劃線操作的討論 1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)?在劃線操作結(jié)束時(shí),仍然需要灼燒接種環(huán)嗎?為什么? 答:操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物;每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后,接種環(huán)上殘留的菌種,使下一次劃線時(shí),接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端,從而通過劃線次數(shù)的增加,使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少,以便得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán),能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種,避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。 2.在灼燒接種環(huán)之后,為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線? 答:以免接種環(huán)溫度太高,殺死菌種。 3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí),為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線? 答:劃線后,線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少,每次從上一次劃線的末端開始,能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少,最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來的菌落。 (6)涂布平板操作的步驟: ①將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。②取少量菌液,滴加到培養(yǎng)基表面。 ③將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃,待酒精燃盡后,冷卻8~10s。 ④用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。 涂布平板操作的討論 涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無(wú)菌操作要求,想一想,第2步應(yīng)如何進(jìn)行無(wú)菌操作? 提示:應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無(wú)菌”。例如,酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍;等等。 菌種的保存 (1)對(duì)于頻繁使用的菌種,可以采用臨時(shí)保藏的方法。 ①臨時(shí)保藏方法 將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上,在合適的溫度下培養(yǎng)。當(dāng)菌落長(zhǎng)成后,將試管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3~6個(gè)月,都要重新將菌種從舊的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上。 ②缺點(diǎn):這種方法保存的時(shí)間不長(zhǎng),菌種容易被污染或產(chǎn)生變異。 (2)對(duì)于需要長(zhǎng)期保存的菌種,可以采用甘油管藏的方法。 在3mL的甘油瓶中,裝入1mL甘油后滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中,與甘油充分混勻后,放在-20℃的冷凍箱中保存。 疑難解答 (1)生物的營(yíng)養(yǎng) 營(yíng)養(yǎng)是指生物攝取、利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過程。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是指維持機(jī)體生命活動(dòng),保證發(fā)育、生殖所需的外源物質(zhì)。 人及動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì):水、無(wú)機(jī)鹽、糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素六類。 植物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì):礦質(zhì)元素、水、二氧化碳等三類。 微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì):水、無(wú)機(jī)鹽、碳源、氮源及特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)五類。 (2)確定培養(yǎng)基制作是否合格的方法 將未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1~2天,無(wú)菌落生長(zhǎng),說明培養(yǎng)基的制備是成功的,否則需要重新制備。 課題二 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù) 尿素 是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥,尿素并不能直接被農(nóng)作物吸收。只有當(dāng)土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后,才能被植物利用。土壤中的細(xì)菌之所以能分解尿素,是因?yàn)樗麄兡芎铣呻迕? 尿素最初是從人的尿液中發(fā)現(xiàn)的 篩選菌株 (1)實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選應(yīng)用的原理 人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等),同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。 (2)選擇性培養(yǎng)基 在微生物學(xué)中,將允許特定種類的微生物生長(zhǎng),同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基,稱作選擇培養(yǎng)基。 (3)配制選擇培養(yǎng)基的依據(jù) 根據(jù)選擇培養(yǎng)的菌種的生理代謝特點(diǎn)加入某種物質(zhì)以達(dá)到選擇的目的。例如,培養(yǎng)基中不加入有機(jī)物可以選擇培養(yǎng)自養(yǎng)微生物;培養(yǎng)基中不加入氮元素,可以選擇培養(yǎng)能固氮的微生物;加入高濃度的食鹽可選擇培養(yǎng)金黃色葡萄球菌等。 統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目 (1)測(cè)定微生物數(shù)量的常用方法有稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計(jì)數(shù)。 (2)稀釋涂布平板法統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目的原理 當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí),培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落,來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù),就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活細(xì)菌。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確,一般設(shè)置3~5個(gè)平板,選擇菌落數(shù)在30~300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù),并取平均值。統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低,因此,統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。 采用此方法的注意事項(xiàng):1.一般選取菌落數(shù)在30~300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù) 2.為了防止菌落蔓延,影響計(jì)數(shù),可在培養(yǎng)基中加入TTC(在計(jì)數(shù)瓊脂中加入適量的TTC(0.5% TTC 1ML加到100ML瓊脂中),細(xì)菌菌落長(zhǎng)成紅顏色,對(duì)去除食品本底顆粒物干擾非常有意義). 3.本法僅限于形成菌落的微生物 設(shè)置對(duì)照 設(shè)置對(duì)照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。對(duì)照實(shí)驗(yàn)是指除了被測(cè)試的條件以外,其他條件都相同的實(shí)驗(yàn),其作用是比照試驗(yàn)組,排除任何其他可能原因的干擾,證明確實(shí)是所測(cè)試的條件引起相應(yīng)的結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括實(shí)驗(yàn)方案,所需儀器、材料、用具和藥品,具體的實(shí)施步驟以及時(shí)間安排等的綜合考慮和安排。 (1)土壤取樣:同其他生物環(huán)境相比,土壤中的微生物,數(shù)量最大,種類最多。在富含有機(jī)質(zhì)的土壤表層,有更多的微生物生長(zhǎng)。從富含有機(jī)物、潮濕、pH≈7的土壤中取樣。鏟去表層土,在距地表約3~8cm的土壤層取樣。 (2)樣品的稀釋:樣品的稀釋程度將直接影響平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)目。在實(shí)際操作中,通常選用一定稀釋范圍的樣品液進(jìn)行培養(yǎng),以保證獲得菌落數(shù)在30~300之間、適于計(jì)數(shù)的平板。 測(cè)定土壤中細(xì)菌的數(shù)量,一般選用104 105 106 測(cè)定放線菌的數(shù)量,一般選用103 104 105 測(cè)定真菌的數(shù)量,一般選用102 103 104 (3)微生物的培養(yǎng)與觀察 不同種類的微生物,往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌30~37℃ 1~2天 放線菌25~28℃ 5~7天 霉菌25~28℃ 3~4天 每隔24小時(shí)統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目,選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果,這樣可以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致一樓菌落的數(shù)目。一般來說,在一定的培養(yǎng)條件下(相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時(shí)間),同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。形狀、大小、隆起程度、顏色 疑難解答 (1)如何從平板上的菌落數(shù)推測(cè)出每克樣品中的菌落數(shù)? 統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù),最好能統(tǒng)計(jì)3個(gè)平板,計(jì)算出平板菌落數(shù)的平均值 每克樣品中的菌落數(shù)=(C/V)*M 其中,C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù),V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml),M代表稀釋倍數(shù) 課題三 分解纖維素的微生物的分離 纖維素,一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物,是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)。 纖維素與纖維素酶 (1)棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物,木材、作物秸稈等也富含纖維素。 (2)纖維素酶是一種復(fù)合酶,一般認(rèn)為它至少包括三種組分,即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶,前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖,第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維素最終被水解成葡萄糖,為微生物的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)。 纖維素分解菌的篩選 (1)篩選方法:剛果紅染色法。能夠通過顏色反應(yīng)直接對(duì)微生物進(jìn)行篩選。 (2)剛果紅染色法篩選纖維素分解菌的原理 剛果紅是一種染料,它可以與像纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復(fù)合物,但并不和水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。當(dāng)我們?cè)诤欣w維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時(shí),剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后,剛果紅-纖維素的復(fù)合物就無(wú)法形成,培養(yǎng)基中會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。這樣,我們就可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。 分離分解纖維素的微生物的實(shí)驗(yàn)流程 土壤取樣→選擇培養(yǎng)(此步是否需要,應(yīng)根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來確定)→梯度稀釋→將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上→挑選產(chǎn)生透明圈的菌落 (1)土壤采集 選擇富含纖維素的環(huán)境。 (2)剛果紅染色法分離纖維素分解菌的步驟 倒平板操作、制備菌懸液、涂布平板 (3)剛果紅染色法種類 一種是先培養(yǎng)微生物,再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng),另一種是在倒平板時(shí)就加入剛果紅。 課題延伸 對(duì)分解纖維素的微生物進(jìn)行了初步的篩選后,只是分離純化的第一步,為確定得到的是纖維素分解菌,還需要進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的實(shí)驗(yàn),纖維素酶的發(fā)酵方法有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種。纖維素酶的測(cè)定方法,一般是對(duì)纖維素酶分解濾紙等纖維素后所產(chǎn)生的葡萄糖進(jìn)行定量的測(cè)定。 疑難解答 (1)為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌? 由于生物與環(huán)境的相互依存關(guān)系,在富含纖維素的環(huán)境中,纖維素分解菌的含量相對(duì)提高,因此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。 (2)將濾紙埋在土壤中有什么作用?你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋進(jìn)土壤多深? 將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對(duì)聚集,實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將紙埋于深約10cm左右腐殖土壤中。 (3)兩種剛果紅染色法的比較 方法一是傳統(tǒng)的方法,缺點(diǎn)是操作繁瑣,加入剛果紅溶液會(huì)使菌落之間發(fā)生混雜;其優(yōu)點(diǎn)是這樣顯示出的顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用。方法二的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便,不存在菌落混雜問題,缺點(diǎn)是由于纖維素和瓊脂、土豆汁中都含有淀粉類物質(zhì),可以使能夠產(chǎn)生淀粉酶的微生物出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)。但這種只產(chǎn)生淀粉酶的微生物產(chǎn)生的透明圈較為模糊,因?yàn)榕囵B(yǎng)基中纖維素占主要地位,因此可以與纖維素酶產(chǎn)生的透明圈相區(qū)分。方法二的另一缺點(diǎn)是:有些微生物具有降解色素的能力,它們?cè)陂L(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過程中會(huì)降解剛果紅形成明顯的透明圈,與纖維素分解菌不易區(qū)分。 (4)為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物? 在選擇培養(yǎng)的條件下,可以使那些能夠適應(yīng)這種營(yíng)養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖,而那些不適應(yīng)這種營(yíng)養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制,因此可以起到“濃縮”的作用。 專題三 植物的組織培養(yǎng)技術(shù) 課題一 菊花的組織培養(yǎng) 植物組織培養(yǎng)的基本過程 細(xì)胞分化:在生物個(gè)體發(fā)育過程中,細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能上出現(xiàn)穩(wěn)定性差異的過程。 離體的植物組織或細(xì)胞,在培養(yǎng)了一段時(shí)間以后,會(huì)通過細(xì)胞分裂,形成愈傷組織,愈傷組織的細(xì)胞排列疏松而無(wú)規(guī)則,是一種高度液泡化的呈無(wú)定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。由高度分化的植物組織或細(xì)胞產(chǎn)生愈傷組織的過程,稱為植物細(xì)胞的脫分化,或者叫做去分化。脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng),又可以重新分化成根或芽等器官,這個(gè)過程叫做再分化。再分化形成的試管苗,移栽到地里,可以發(fā)育成完整的植物體。 植物細(xì)胞工程 具有某種生物全套遺傳信息的任何一個(gè)活細(xì)胞,都具有發(fā)育成完整個(gè)體的能力,即每個(gè)生物細(xì)胞都具有全能性。但在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育過程中并不表現(xiàn)出來,這是因?yàn)樵谔囟ǖ臅r(shí)間和空間條件下,通過基因的選擇性表達(dá),構(gòu)成不同組織和器官。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用有:實(shí)現(xiàn)優(yōu)良品種的快速繁殖;培育脫毒作物;制作人工種子;培育作物新品種以及細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)等。 ·細(xì)胞分化是一種持久性的變化,它有什么生理意義? 使多細(xì)胞生物體中細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能趨向?qū)iT化,有利于提高各種生理功能的效率。 比較根尖分生組織和愈傷組織的異同 組織類型 細(xì)胞來源 細(xì)胞形態(tài) 細(xì)胞結(jié)構(gòu) 細(xì)胞排列 細(xì)胞去向 根尖 分生組織 受精卵 正方形 無(wú)液泡 緊密 分化成多種 細(xì)胞組織 愈傷組織 高度分化細(xì)胞 無(wú)定形 高度液泡化 疏松 再分化成新個(gè)體 相同點(diǎn) 都通過有絲分裂進(jìn)行細(xì)胞增殖 影響植物組織培養(yǎng)的條件 材料:不同的植物組織,培養(yǎng)的難易程度差別很大。植物材料的選擇直接關(guān)系到試驗(yàn)的成敗。植物的種類、材料的年齡和保存時(shí)間的長(zhǎng)短等都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。菊花組織培養(yǎng)一般選擇未開花植物的莖上部新萌生的側(cè)枝作材料。一般來說,容易進(jìn)行無(wú)性繁殖的植物容易進(jìn)行組織培養(yǎng)。選取生長(zhǎng)旺盛嫩枝進(jìn)行組培的是嫩枝生理狀態(tài)好,容易誘導(dǎo)脫分化和再分化。 營(yíng)養(yǎng):離體的植物組織和細(xì)胞,對(duì)營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境等條件的要求相對(duì)特殊,需要配制適宜的培養(yǎng)基。常用的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基,其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg,微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co,有機(jī)物有甘氨酸、煙酸、肌醇、維生素、蔗糖等。 激素:植物激素中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是啟動(dòng)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵性激素。在生長(zhǎng)素存在的情況下,細(xì)胞分裂素的作用呈現(xiàn)加強(qiáng)趨勢(shì)。在培養(yǎng)基中需要添加生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素等植物激素,其濃度、使用的先后順序、用量的比例等都影響結(jié)果。 使用順序 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 先生長(zhǎng)素, 后細(xì)胞分裂素 有利于分裂但不分化 先細(xì)胞分裂素, 后生長(zhǎng)素 細(xì)胞既分裂也分化 同時(shí)使用 分化頻率提高 生長(zhǎng)素/ 細(xì)胞分裂素比值與結(jié)果 比值高時(shí) 促根分化, 抑芽形成 比值低時(shí) 促芽分化, 抑根形成 比值適中 促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng) + 環(huán)境條件:PH、溫度、光等環(huán)境條件。 不同的植物對(duì)各種條件的要求往往不同。進(jìn)行菊花的組織培養(yǎng),一般將pH控制在5.8左右,溫度控制在18~22℃,并且每日用日光燈照射12h. 4、 操作流程 配制MS固體培養(yǎng)基:配制各種母液:將各種成分按配方比例配制成的濃縮液(培養(yǎng)基母液)。 ·使用時(shí)根據(jù)母液的濃縮倍數(shù),計(jì)算用量,并加蒸餾水稀釋。 ·配制培養(yǎng)基:應(yīng)加入的物質(zhì)有瓊脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有機(jī)物和植物激素的母液,并用蒸餾水定容到1000毫升。 ·在菊花組織培養(yǎng)中,可以不添加植物激素 原因是菊花莖段組織培養(yǎng)比較容易?!缇翰扇〉臏缇椒ㄊ歉邏赫羝麥缇?。 ·MS培養(yǎng)基中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用是什么?與肉湯培養(yǎng)基相比,MS培養(yǎng)基有哪些特點(diǎn)? 大量元素和微量元素提供植物細(xì)胞所必需的無(wú)機(jī)鹽;蔗糖提供碳源,維持細(xì)胞滲透壓;甘氨酸、維生素等物質(zhì)主要是為了滿足離體植物細(xì)胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產(chǎn)生的特殊營(yíng)養(yǎng)需求。 微生物培養(yǎng)基以有機(jī)營(yíng)養(yǎng)為主,MS培養(yǎng)基則需提供大量無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)。 外植體的消毒 外植體:用于離體培養(yǎng)的植物器官或組織片段。選取菊花莖段時(shí),要取生長(zhǎng)旺盛的嫩枝。菊花莖段用流水沖洗后可加少許洗衣粉,用軟刷輕輕刷洗,刷洗后在流水下沖洗20min左右。用無(wú)菌吸水紙吸干外植體表面的水分,放入體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精中搖動(dòng)2~3次,持續(xù)6~7s,立即將外植體取出,在無(wú)菌水中清洗。取出后仍用無(wú)菌吸水紙吸干外植體表面水分,放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞溶液中1~2min。取出后,在無(wú)菌水中至少清洗3次,漂洗消毒液。 注意:對(duì)外植體進(jìn)行表面消毒時(shí),就要考慮藥劑的消毒效果,又要考慮植物的耐受能力。 接種:接種過程中插入外植體時(shí)形態(tài)學(xué)上端朝上,每個(gè)錐形瓶接種7~8個(gè)外植體。外植體接種與細(xì)菌接種相似,操作步驟相同,而且都要求無(wú)菌操作。 培養(yǎng):應(yīng)該放在無(wú)菌箱中進(jìn)行,并定期進(jìn)行消毒,保持適宜的溫度(18~22℃)和光照(12h) 移栽:栽前應(yīng)先打開培養(yǎng)瓶的封口膜,讓其在培養(yǎng)間生長(zhǎng)幾日,然后用流水清洗根部培養(yǎng)基。然后將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境中生活一段時(shí)間,進(jìn)行壯苗。最后進(jìn)行露天栽培。 栽培 外植體在培養(yǎng)過程中可能會(huì)被污染,原因有外植體消毒不徹底;培養(yǎng)基滅菌不徹底;接種中被雜菌污染;錐形瓶密封性差等。 專題二 月季的花藥培養(yǎng) 被子植物的花粉發(fā)育被子植物的雄蕊通常包含花絲、花藥兩部分。花藥為囊狀結(jié)構(gòu),內(nèi)部含有許多花粉?;ǚ凼怯苫ǚ勰讣?xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂而形成的,因此,花粉是單倍體的生殖細(xì)胞。被子植物花粉的發(fā)育要經(jīng)歷小孢子四分體時(shí)期、單核期和雙核期等階段。在小孢子四分體時(shí)期,4個(gè)單倍體細(xì)胞連在一起,進(jìn)入單核期時(shí),四分體的4個(gè)單倍體細(xì)胞彼此分離,形成4個(gè)具有單細(xì)胞核的花粉粒。這時(shí)的細(xì)胞含濃厚的原生質(zhì),核位于細(xì)胞的中央(單核居中期)。隨著細(xì)胞不斷長(zhǎng)大,細(xì)胞核由中央移向細(xì)胞一側(cè)(單核靠邊期),并分裂成1個(gè)生殖細(xì)胞核和1個(gè)花粉管細(xì)胞核,進(jìn)而形成兩個(gè)細(xì)胞,一個(gè)是生殖細(xì)胞,一個(gè)是營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。生殖細(xì)胞將在分裂一次,形成兩個(gè)精子。 注意:①成熟的花粉粒有兩類,一類是二核花粉粒,其花粉粒中只含花粉管細(xì)胞核和生殖細(xì)胞核,二核花粉粒的精子是在花粉管中形成的;另一類是三核花粉粒,花粉在成熟前,生殖細(xì)胞就進(jìn)行一次有絲分裂,形成兩個(gè)精子,此花粉粒中含有兩個(gè)精子核和一個(gè)花粉管核(營(yíng)養(yǎng)核)②花粉發(fā)育過程中的四分體和動(dòng)物細(xì)胞減數(shù)分裂的四分體不同?;ǚ郯l(fā)育過程中的四分體是花粉母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂形成的4個(gè)連在一起的單倍體細(xì)胞;而動(dòng)物細(xì)胞減數(shù)分裂過程中的四分體是聯(lián)會(huì)配對(duì)后的一對(duì)同源染色體,由于含有四條染色單體而稱為四分體。③同一生殖細(xì)胞形成的兩個(gè)精子,其基因組成完全相同。 產(chǎn)生花粉植株的兩種途徑通過花藥培養(yǎng)產(chǎn)生花粉植株(即單倍體植株)一般有兩種途徑,一種是花粉通過胚狀體階段發(fā)育為植物,另一種是花粉在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上先形成愈傷組織,再將其誘導(dǎo)分化成植株。這兩種途徑之間并沒有絕對(duì)的界限,主要取決于培養(yǎng)基中激素的種類及其濃度配比。 注意:①無(wú)論哪種產(chǎn)生方式,都要先誘導(dǎo)生芽,再誘導(dǎo)生根②胚狀體:植物體細(xì)胞組織培養(yǎng)過程中,誘導(dǎo)產(chǎn)生的形態(tài)與受精卵發(fā)育成的胚非常類似的結(jié)構(gòu),其發(fā)育也與受精卵發(fā)育成的胚類似,有胚芽、胚根、胚軸等完整結(jié)構(gòu),就像一粒種子,又稱為細(xì)胞胚。 影響花藥培養(yǎng)的因素誘導(dǎo)花粉能否成功及誘導(dǎo)成功率的高低,受多種因素影響,其中材料的選擇與培養(yǎng)基的組成是主要的影響因素 ·親本的生理狀況:花粉早期是的花藥比后期的更容易產(chǎn)生花粉植株,選擇月季的初花期。 ·合適的花粉發(fā)育時(shí)期:一般來說,在單核期,細(xì)胞核由中央移向細(xì)胞一側(cè)的時(shí)期,花藥培養(yǎng)成功率最高 ·花蕾:選擇完全未開放的花蕾 ·親本植株的生長(zhǎng)條件、材料的低溫預(yù)處理以及接種密度等對(duì)誘導(dǎo)成功率都有一定影響 ·材料的選?。哼x擇花藥時(shí),一般要通過鏡檢來確定其中的花粉是否處于適宜的發(fā)育期。確定花粉發(fā)育時(shí)期的最常用的方法是醋酸洋紅法。但是,某些植物的花粉細(xì)胞核不易著色,需采用焙花青-鉻礬法,這種方法能將花粉細(xì)胞核染成藍(lán)黑色 ·材料的消毒 ·接種和培養(yǎng):滅菌后的花蕾,要在無(wú)菌條件下除去萼片和花瓣,并立即將花藥接種到培養(yǎng)基上。在剝離花藥時(shí),要盡量不損傷花藥(否則接種后容易從受傷部位長(zhǎng)生愈傷組織),同時(shí)還要徹底去除花絲,因?yàn)榕c花絲相連的花藥不利于愈傷組織或胚狀體的形成,通常每瓶接種花藥7~10個(gè),培養(yǎng)溫度控制在25℃左右,不需要光照.幼小植株形成后才需要光照.一般經(jīng)過20~30天培養(yǎng)后,會(huì)發(fā)現(xiàn)花藥開裂,長(zhǎng)出愈傷組織或形成胚狀體。將愈傷組織及時(shí)轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上,以便進(jìn)一步分化出再生植株。如果花藥開裂釋放出胚狀體,則一個(gè)花藥內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生大量幼小植株,必須在花藥開裂后盡快將幼小植株分開,分別移植到新的培養(yǎng)基上,否則這些植株將很難分開。還需要對(duì)培養(yǎng)出來的植株做進(jìn)一步的鑒定和篩選。 植物組織培養(yǎng)技術(shù)與花藥培養(yǎng)技術(shù)的相同之處是:培養(yǎng)基配制方法、無(wú)菌技術(shù)及接種操作等基本相同。兩者的不同之處在于:花藥培養(yǎng)的選材非常重要,需事先摸索時(shí)期適宜的花蕾;花藥裂開后釋放出的愈傷組織或胚狀體也要及時(shí)更換培養(yǎng)基;花藥培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)基配方的要求更為嚴(yán)格。這些都使花藥培養(yǎng)的難度大為增加。 專題4 酶的研究與應(yīng)用知識(shí)點(diǎn) 課題1 果膠酶在果汁生產(chǎn)中的作用 由水果制作果汁要解決兩個(gè)主要問題:一是果肉的出汁率低,耗時(shí)長(zhǎng);二是榨取的果汁渾濁、黏度高,容易發(fā)生沉淀。 1、植物細(xì)胞壁以及胞間層的主要組成成分有纖維素和_果膠_。并且兩者不溶于水,在果汁加工中,既影響出汁率,又使果汁渾濁。 2、果膠是植物細(xì)胞壁以及胞間層的主要組成成分之一,它是由半乳糖醛酸聚合而成的一種高分子化合物,不溶于水。在果汁加工中,果膠不僅會(huì)影響出汁率,還會(huì)使果汁渾濁。果膠酶的作用是能夠?qū)⒐z_分解成可溶性的_半乳醛酸,瓦解植物的細(xì)胞壁及胞間層,并且使果汁變得澄清。 3、果膠酶是一類酶總稱,包括_果膠分解酶 、 多聚半乳糖醛酸酶 、果膠酯酶_等。 4、酶的活性是指 酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的 的能力。酶活性的高低可以用在一定條件下,酶所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速度 來表示。在科學(xué)研究與工業(yè)生產(chǎn)中,酶反應(yīng)速度用單位時(shí)間內(nèi)、單位體積中反應(yīng)物的減小量或產(chǎn)物的增加量來表示。 5、影響酶活性的因素包括:溫度 、PH、酶的抑制劑等。 (二).實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 〔設(shè)計(jì)一〕探究溫度對(duì)酶活性的影響 當(dāng)酶處于最適溫度或最適pH時(shí),酶的活性最高;若溫度過高、過酸或過堿,則導(dǎo)致酶變性失活。在一定范圍內(nèi),果肉的出汁率和果汁的澄清度與果膠酶的活性成正比。 此實(shí)驗(yàn)的自變量是溫度 _;根據(jù)單一變量原則,你應(yīng)確保各實(shí)驗(yàn)組相同的變量有_PH 底物濃度底物量 實(shí)驗(yàn)器材 酶的用量 等等_。 〔設(shè)計(jì)二〕探究PH對(duì)酶活性的影響 探究pH對(duì)果膠酶活性的影響,只須將溫度梯度改成pH梯度,并選定一個(gè)適宜的溫度進(jìn)行水浴加熱。反應(yīng)液中的pH可以通過體積分?jǐn)?shù)為0.1%的氫氧化鈉或鹽酸溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。 〔設(shè)計(jì)三〕探究果膠酶的用量 探究果膠酶的用量是建立在探究最適溫度和pH對(duì)果膠酶活性影響的基礎(chǔ)之上的。此時(shí),研究的變量是果膠酶的用量,其他因素都應(yīng)保持不變。實(shí)驗(yàn)時(shí)可以配制不同濃度的果膠酶溶液,也可以只配制一種濃度的果膠酶溶液,然后使用不同的體積即可。需要注意的是,反應(yīng)液的pH必須相同,否則將影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn) 旁欄思考題 1.為什么在混合蘋果泥和果膠酶之前,要將果泥和果膠酶分裝在不同的試管中恒溫處理? 提示:將果泥和果膠酶分裝在不同的試管中恒溫處理,可以保證底物和酶在混合時(shí)的溫度是相同的,避免了果泥和果膠酶混合時(shí)影響混合物的溫度,從而影響果膠酶活性的問題。 2.在探究溫度或pH的影響時(shí),是否需要設(shè)置對(duì)照?如果需要,又應(yīng)該如何設(shè)置?為什么? 提示:需要設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn),不同的溫度梯度之間或不同的pH梯度之間就可以作為對(duì)照,這種對(duì)照稱為相互對(duì)照。 3.A同學(xué)將哪個(gè)因素作為變量,控制哪些因素不變?為什么要作這樣的處理?B同學(xué)呢? 提示:A同學(xué)將溫度或pH作為變量,控制不變的量有蘋果泥的用量、果膠酶的用量、反應(yīng)的時(shí)間和過濾的時(shí)間等。只有在實(shí)驗(yàn)中保證一個(gè)自變量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果才能說明問題。B同學(xué)對(duì)于變量的處理應(yīng)該與A同學(xué)相同,只是觀察因變量的角度不同。 4.想一想,為什么能夠通過測(cè)定濾出的蘋果汁的體積大小來判斷果膠酶活性的高低? 提示:果膠酶將果膠分解為小分子物質(zhì),小分子物質(zhì)可以通過濾紙,因此蘋果汁的體積大小反應(yīng)了果膠酶的催化分解果膠的能力。在不同的溫度和pH下,果膠酶的活性越大,蘋果汁的體積就越大。 5.當(dāng)探究溫度對(duì)果膠酶活性的影響時(shí),哪個(gè)因素是變量,哪些因素應(yīng)該保持不變? 提示:溫度是變量,應(yīng)控制果泥量、果膠酶的濃度和用量、水浴時(shí)間和混合物的pH等所有其他條件不變。只有這樣才能保證只有溫度一個(gè)變量對(duì)果膠酶的活性產(chǎn)生影響。 實(shí)驗(yàn)變量與反應(yīng)變量(如表) 實(shí)驗(yàn)變量(自變量) 反應(yīng)變量(因變量) 含義 實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)者所操縱的因素或條件 由于實(shí)驗(yàn)變量改變而引起的變化和結(jié)果 實(shí)例 溫度或pH 果汁量 聯(lián)系 實(shí)驗(yàn)變量為原因,反應(yīng)變量是結(jié)果,二者是因果關(guān)系 課題2 探討加酶洗衣粉的洗滌效果 1、酶絕大多數(shù)是蛋白質(zhì),少數(shù)為RNA;酶具有生物 催化 作用;酶具有高效 性、專一性特點(diǎn),但易受溫度、PH、表面活性劑等因素的影響。 (1)加酶洗衣粉是指含酶制劑 的洗衣粉,目前常用的酶制劑有蛋白酶 、 脂肪酶 、淀粉酶和纖維素酶四類。普通洗衣粉中含磷,含磷的污水排放可能導(dǎo)致 微生物和藻類大量繁殖,造成水體污染,加酶洗衣粉可以降低表面活性劑和三聚磷酸鈉,使洗滌劑朝無(wú)磷的方向發(fā)展,減少對(duì)環(huán)境的污染。 (2)脂肪酶可以將脂肪分解成 甘油和脂肪酸,蛋白酶可以將蛋白質(zhì)分解成 小分子肽和氨基酸 ,小分子肽可在 肽酶 作用下分解成氨基酸;淀粉酶可以將淀粉分解成 可溶性麥芽糖,纖維素酶可以將纖維素分解成 葡萄糖 ,以達(dá)到去污的目的,因此,蛋白類纖維織物(羊毛、蠶絲等)不能用 加(蛋白)酶洗衣粉 來洗滌。 (3)應(yīng)用最廣泛、效果最明顯的是 堿性蛋白 酶和 堿性脂肪 酶。 堿性蛋白酶能將血漬 、 奶漬等含有大分子蛋白質(zhì)水解成可溶性的氨基酸或 小分子的肽,使污跡容易從衣物上脫落。 (4)衣物的洗滌,不僅要考慮到洗滌效果,還要考慮衣物的承受能力 、 洗滌成本等因素。 (5)加酶洗衣粉可以降低表面活性劑和三聚磷酸鈉的用量,使洗衣粉朝低磷無(wú)磷的方向發(fā)展,減少對(duì)環(huán)境的污染。 2、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)遵循原則:是單一變量原則、對(duì)照原則和等量原則,比如探究普通洗衣粉和加酶洗衣粉對(duì)衣物污漬的洗滌效果有何不同時(shí),用控制使用不同種類洗衣粉為變量,其他條件完全一致;同時(shí)普通洗衣粉處理污漬物與加酶洗衣粉處理污漬物形成 對(duì)照 實(shí)驗(yàn)。 3.不同種類的酶洗衣粉對(duì)同一污漬的洗滌效果 (1)實(shí)驗(yàn)原理:不同種類的加酶洗衣粉所加的酶不同,而酶具有 專一性 ,所以對(duì)不同污漬的洗滌效果不同。 4、比較普通洗衣粉和加酶洗衣粉去污原理的異同 普通洗衣粉 加酶洗衣粉 相同點(diǎn) 表面活性劑可以產(chǎn)生泡沫,將油脂分子分散開,水軟化劑可以分散污垢,等 不同點(diǎn) 酶可以將大分子有機(jī)物分解為小分子有機(jī)物,小分子有機(jī)物易溶于水,從而與纖維分開 專題五 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù) 課題一 DNA的粗提取與鑒定 ·提取DNA的溶解性原理包括哪些方面? DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同;DNA不溶于酒精。 ·DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度有何特點(diǎn)?要使DNA溶解,需要使用什么濃度?要使DNA析出,又需要使用什么濃度? 在0.14mol/L時(shí)溶解度最??;較高濃度可使DNA溶解;0.14mol/L可使DNA析出。 ·在溶解細(xì)胞中的DNA時(shí),人們通常選用2mol/LNaCl溶液;將DNA分子析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中緩慢注入蒸餾水,以稀釋NaCl溶液。酒精是一種常用有機(jī)溶劑,但DNA卻不能溶于酒精(特別是95%冷卻酒精),但細(xì)胞中蛋白質(zhì)可溶于酒精。 從理論上分析,預(yù)冷的乙醇溶液具有以下優(yōu)點(diǎn)。一是抑制核酸水解酶活性,防止DNA降解;二是降低分子運(yùn)動(dòng),易于形成沉淀析出;三是低溫有利于增加DNA分子柔韌性,減少斷裂。 ·采用DNA不溶于酒精的原理,可以達(dá)到什么目的? 將DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。 ·提取DNA還可以利用DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性原理。利用該原理時(shí),應(yīng)選用怎樣的酶和怎樣的溫度值? 蛋白酶,因?yàn)槊妇哂袑R恍?,蛋白酶只水解蛋白質(zhì)而不會(huì)對(duì)DNA產(chǎn)生影響。溫度值為60~75℃,因?yàn)樵摐囟戎档鞍踪|(zhì)變性沉淀,而DNA不會(huì)變性。 補(bǔ)充:DNA的變性是指DNA分子在高溫下解螺旋,其溫度在80℃以上,如在PCR技術(shù)中DNA變性溫度在95℃。 ·洗滌劑在提取DNA中有何作用? 洗滌劑瓦解細(xì)胞膜。 ·當(dāng)鑒定提取出的物質(zhì)是否是DNA時(shí),需要使用什么指示劑進(jìn)行鑒定? 在沸水浴條件下,DNA遇二苯胺呈現(xiàn)藍(lán)色。 原理總結(jié):通過利用不同濃度NaCl溶液溶解或析出DNA,可以從細(xì)胞中提取和提純DNA;再利用酒精進(jìn)一步將DNA與蛋白質(zhì)分離開來,達(dá)到提純的目的;最后利用二苯胺試劑鑒定提取的物質(zhì)是否是DNA。 實(shí)驗(yàn)材料的選取 不同生物的組織中DNA含量不同。在選取材料時(shí),應(yīng)本著DNA含量高、材料易得、便于提取的原則。 本實(shí)驗(yàn)用雞血細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)材料有兩個(gè)原因。一是因?yàn)殡u血細(xì)胞核的DNA含量豐富,材料易得;二是雞血細(xì)胞極易吸水脹破,而用動(dòng)物肝臟細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料常常需要?jiǎng)驖{和離心,對(duì)設(shè)備要求較高,操作繁瑣,歷時(shí)較長(zhǎng)。 雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,所以在提取過程中為了減少DNA的損失,最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細(xì)胞液。 破碎細(xì)胞,獲取含DNA的濾液 ·若選用雞血和洋蔥作實(shí)驗(yàn)材料,則怎樣獲取含DNA的濾液? 在雞血細(xì)胞液中加入一定量蒸餾水并用玻棒攪拌,過濾后收集濾液;切碎洋蔥,加入一定量洗滌劑和食鹽,攪拌研磨,過濾后收集濾液。 ·為什么加入蒸餾水能使雞血細(xì)胞破裂? 答:蒸餾水對(duì)于雞血細(xì)胞來說是一種低滲液體,水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi),使血細(xì)胞脹裂,再加上攪拌的機(jī)械作用,就加速了雞血細(xì)胞的破裂(細(xì)胞膜和核膜的破裂),從而釋放出DNA。 ·在以上實(shí)驗(yàn)中,加入蒸餾水、洗滌劑和食鹽的作用分別是什么?過濾時(shí)應(yīng)當(dāng)選用(濾紙、尼龍布)。血細(xì)胞在蒸餾水中大量吸水而張裂;洗滌劑瓦解細(xì)胞膜;食鹽溶解DNA物質(zhì);選用尼龍布進(jìn)行過濾。 ·在處理植物組織時(shí)需要進(jìn)行研磨,其目的是什么?研磨不充分產(chǎn)生什么結(jié)果? 破碎細(xì)胞壁,使核物質(zhì)容易溶解在NaCl溶液中;研磨不充分會(huì)使DNA的提取量減少,影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。 。具體做法。10mL雞血+20mL蒸餾水→同方向攪拌→3層尼龍布過濾→濾液 去除濾液中的雜質(zhì) 為什么反復(fù)地溶解與析出DNA,能夠去除雜質(zhì)? 用高鹽濃度的溶液溶解DNA,能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì);用低鹽濃度使DNA析出,能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此,通過反復(fù)溶解與析出DNA,就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質(zhì)。 最初獲得的DNA濾液含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì),需要進(jìn)一步提純DNA。 方案一的原理是DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同;方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質(zhì),不分解DNA;方案三的原理是蛋白質(zhì)和DNA的變性溫度不同。 方案二與方案三的原理有什么不同? 答:方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白,從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開;方案三利用的是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同,從而使蛋白質(zhì)變性,與DNA分離。 析出與鑒定 ·在濾液中仍然含有一些雜質(zhì),怎樣除去這些雜質(zhì)呢?得到的DNA呈何顏色? 濾液與等體積的冷卻酒精混合均勻,靜置2~3分鐘,析出的白色絲狀物就是DNA。DNA呈白色。 ·怎樣鑒定析出的白色絲狀物就是DNA呢? 具體做法。試管2支,編號(hào)甲乙→各加等量5mLNaCl溶液→甲中放入少量白色絲狀物,使之溶解→各加4mL二苯胺,混合均勻→沸水浴5min→觀察顏色變化 實(shí)驗(yàn)操作 制備雞血細(xì)胞液…………加檸檬酸鈉,靜置或離心 ↓ 破碎細(xì)胞,釋放DNA… 加蒸餾水,同一方向快速通方向攪拌 ↓→過濾,除去細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等。 溶解核內(nèi)DNA………… 加入NaCl至2mol/L,同一方向緩慢攪拌 ↓ DNA析出……………… 加蒸餾水至0.14mol/L,過濾,在溶解到2mol/L溶液中 ↓→除去細(xì)胞質(zhì)中的大部分物質(zhì)。 DNA初步純化………… 與等體積95%冷卻酒精混合,析出白色絲狀物 ↓→除去核蛋白、RNA、多糖等。 DNA鑒定……………… 二苯胺,沸水浴,呈現(xiàn)藍(lán)色 注意事項(xiàng):在雞血中加入檸檬酸鈉防止凝固;雞血靜置或離心以提高細(xì)胞懸液濃度;使用塑料燒杯;使用尼龍布過濾;玻棒沿同一方向攪拌;玻棒攪拌要緩慢(細(xì)胞破裂快速攪拌);玻棒不要碰到燒杯壁;二苯胺試劑要現(xiàn)用現(xiàn)配等。 專題六 植物有效成分的提取 課題一 植物芳香油的提取 天然香料的來源:植物、動(dòng)物 不同植物的根、莖、葉、花、果實(shí)、種子都可以提取芳香油。 芳香油的提取方法:蒸餾、壓榨、萃取等。 芳香油的性質(zhì):揮發(fā)性強(qiáng),成分復(fù)雜,以萜類化合物及其衍生物為主。 水蒸氣蒸餾法: 原理:水蒸汽可將揮發(fā)性較強(qiáng)的芳香油攜帶出來形成油水混合物,冷卻后水油分層。 方法:水中蒸餾:原料放在沸水中加熱蒸餾。 水上蒸餾:原料隔放在沸水上加熱蒸餾。 水汽蒸餾:利用外來高溫水蒸氣加熱蒸餾。 不足:有些原料不適宜于水中蒸餾,如柑橘、檸檬等易焦糊,有效成分容易水解。通常用壓榨法(通過機(jī)械壓縮力將液相物從液固兩相混合物中分離出來的一種簡(jiǎn)單操作) 萃取法: 原理:芳香油易溶于有機(jī)溶劑,溶劑揮發(fā)后得到芳香油。如石油醚、酒精、乙醚等。 方法:原料浸泡在溶劑中→得到浸泡液→有機(jī)溶劑揮發(fā)→芳香油。 不足:有機(jī)溶劑中的雜質(zhì)影響芳香油的品質(zhì) 蒸餾裝置包括:鐵架臺(tái)兩個(gè)、酒精燈、石棉網(wǎng)、蒸餾瓶、橡膠塞、蒸餾頭、溫度計(jì)、直型冷凝管、接液管、錐形瓶,以及連接進(jìn)水口和出水口的橡皮管。所有儀器必須事先干燥,保證無(wú)水。整套蒸餾裝置可分為左、中、右三部分,其中左邊的部分通過加熱進(jìn)行蒸餾,中部將蒸餾物冷凝,右邊的部分用來接收。安裝儀器一般都按照自下而上、從左到右的順序。拆卸儀器的順序與安裝時(shí)相反。具體安裝順序和方法如下。 (1)固定熱源──酒精燈。 (2)固定蒸餾瓶,使其離熱源的距離如教科書中圖6-2所示,并且保持蒸餾瓶軸心與鐵架臺(tái)的水平面垂直。 (3)安裝蒸餾頭,使蒸餾頭的橫截面與鐵架臺(tái)平行。 (4)連接冷凝管。保證上端出水口向上,通過橡皮管與水池相連;下端進(jìn)水口向下,通過橡皮管與水龍頭相連。 (5)連接接液管(或稱尾接管)。 (6)將接收瓶瓶口對(duì)準(zhǔn)尾接管的出口。常壓蒸餾一般用錐形瓶而不用燒杯作接受器,接收瓶應(yīng)在實(shí)驗(yàn)前稱重,并做好記錄。 (7)將溫度計(jì)固定在蒸餾頭上,使溫度計(jì)水銀球的上限與蒸餾頭側(cè)管的下限處在同一水平線上。 蒸餾裝置安裝完畢后,可以在蒸餾瓶中加幾粒沸石,防止液體過度沸騰。打開水龍頭,緩緩?fù)ㄈ肜渌?,然后開始加熱。加熱時(shí)可以觀察到,蒸餾瓶中的液體逐漸沸騰,蒸氣逐漸上升,溫度計(jì)讀數(shù)也略有上升。當(dāng)蒸氣的頂端達(dá)到溫度計(jì)水銀球部位時(shí),溫度計(jì)讀數(shù)急劇上升。在整個(gè)蒸餾過程中,應(yīng)保證溫度計(jì)的水銀球上常有因冷凝作用而形成的液滴??刂普麴s的時(shí)間和速度,通常以每秒1~2滴為宜。 分液漏斗的使用方法如下。 (1)首先把活塞擦干,為活塞均勻涂上一層潤(rùn)滑脂,注意切勿將潤(rùn)滑脂涂得太厚或使?jié)櫥M(jìn)入活塞孔中,以免污染萃取液。 (2)塞好活塞后,把活塞旋轉(zhuǎn)幾圈,使?jié)櫥植季鶆?。并用水檢查分液漏斗的頂塞與活塞處是否滲漏,確認(rèn)不漏水后再使用。 (3)將分液漏斗放置在大小合適的、并已固定在鐵架臺(tái)上的鐵圈- 1.請(qǐng)仔細(xì)閱讀文檔,確保文檔完整性,對(duì)于不預(yù)覽、不比對(duì)內(nèi)容而直接下載帶來的問題本站不予受理。
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