結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2017年第25號(hào)）

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—1——附件結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測試劑注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊(cè)申請(qǐng)人對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測試劑注冊(cè)申報(bào)資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時(shí)也為技術(shù)審評(píng)部門對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的技術(shù)審評(píng)提供參考。本指導(dǎo)原則是針對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測試劑的一般要求，申請(qǐng)人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需闡述具體理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對(duì)注冊(cè)申報(bào)資料的內(nèi)容進(jìn)行充實(shí)和細(xì)化。本指導(dǎo)原則是對(duì)注冊(cè)申請(qǐng)人和審查人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊(cè)審批所涉及的行政事項(xiàng)，也不作為法規(guī)強(qiáng)制執(zhí)行，如果有能夠滿足相關(guān)法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要詳細(xì)闡明理由，并對(duì)其科學(xué)合理性進(jìn)行驗(yàn)證，提供詳細(xì)的研究資料和驗(yàn)證資料，相關(guān)人員應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)體系以及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。一、范圍本指導(dǎo)原則所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測試—2——?jiǎng)┦侵福豪梅肿由飳W(xué)技術(shù)，對(duì)結(jié)核病患者的臨床樣本或培養(yǎng)物樣本中的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變進(jìn)行體外定性檢測的試劑。針對(duì)該定義，需要強(qiáng)調(diào)如下幾點(diǎn)。1.適用人群為：結(jié)核病患者。特別注意的是，對(duì)于同一注冊(cè)單元內(nèi)可同時(shí)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測以及耐藥基因突變檢測的雙功能試劑，盡管其核酸檢測部分的適用人群為疑似結(jié)核病患者，但只有核酸陽性才能進(jìn)行下一步的耐藥基因突變檢測，因此其耐藥基因突變檢測部分的適用人群為結(jié)核病患者。2.適用樣本可為：2.1 痰、支氣管肺泡灌洗液或其他體液等臨床樣本或培養(yǎng)物樣本；2.2 進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測的上述樣本應(yīng)為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的樣本。即：來自結(jié)核病患者的、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的痰、支氣管肺泡灌洗液或其他體液等臨床樣本或培養(yǎng)物樣本。3.結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的確認(rèn)方法可為：已獲國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)上市的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢測試劑或臨床普遍認(rèn)可的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定方法（如：結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑或傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群培養(yǎng)鑒定方法）。4.對(duì)于同一注冊(cè)單元內(nèi)可同時(shí)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測以及耐藥基因突變檢測的雙功能試劑，其耐藥基因突變—3——檢測部分適用于本指導(dǎo)原則。本指導(dǎo)原則所述產(chǎn)品的預(yù)期用途可表述為以下三種類型：1.申報(bào)產(chǎn)品可區(qū)分具體突變類型，結(jié)果報(bào)告具體突變類型（a 類） 。建議表述為：本產(chǎn)品用于體外定性檢測來自結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的 xx 樣本中的 yy 耐藥基因突變，可檢測的突變類型包括 zz，本產(chǎn)品可區(qū)分具體突變類型。2.已知申報(bào)產(chǎn)品可檢測的具體突變類型（如：針對(duì)具體突變類型設(shè)計(jì)特異突變探針，從檢驗(yàn)原理上已知可檢測哪些突變類型） ，但結(jié)果不區(qū)分具體突變類型，結(jié)果報(bào)告為耐藥/敏感等（b 類） 。建議表述為：本產(chǎn)品用于體外定性檢測來自結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的 xx 樣本中的 yy 耐藥基因突變，可檢測的突變類型包括 zz，本產(chǎn)品不區(qū)分具體突變類型。3.某段核酸區(qū)域的突變可導(dǎo)致對(duì)某種藥物耐藥，申報(bào)產(chǎn)品從檢驗(yàn)原理上沒有必要明確具體突變類型，結(jié)果報(bào)告為耐藥/敏感（c 類） 。建議表述為：本產(chǎn)品用于體外定性檢測來自結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的 xx 樣本中的 yy 耐藥，本產(chǎn)品無法明確具體突變類型。本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求是基于熒光探針 PCR 方法確立的，對(duì)于線性雜交或基因芯片等其他核酸檢測技術(shù)，可能部分要求不完全適用或本指導(dǎo)原則所述技術(shù)指標(biāo)不夠全面，注冊(cè)申請(qǐng)人可根據(jù)產(chǎn)品特性選擇合適的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)和驗(yàn)證，但需闡述不適用的理由，并驗(yàn)證其科學(xué)合理性，同時(shí)確認(rèn)性能評(píng)價(jià)的充分—4——性。本指導(dǎo)原則適用于進(jìn)行首次注冊(cè)申報(bào)和相關(guān)許可事項(xiàng)變更的產(chǎn)品。二、注冊(cè)申報(bào)資料要求（一）綜述資料綜述資料主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、研究結(jié)果的總結(jié)評(píng)價(jià)以及同類產(chǎn)品上市情況介紹等內(nèi)容，其中同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從檢測靶標(biāo)、方法學(xué)及不同基因突變類型檢出能力等方面寫明申報(bào)產(chǎn)品與目前市場上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的主要區(qū)別。若尚無同類產(chǎn)品批準(zhǔn)上市，則應(yīng)提交詳實(shí)充分的科學(xué)證據(jù)，包括：突變區(qū)域、突變類型與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群表型耐藥的相關(guān)性以及突變檢測的臨床意義，證明申報(bào)產(chǎn)品的檢測靶標(biāo)具有明確的臨床意義。綜述資料應(yīng)符合《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第 5 號(hào)，以下簡稱《辦法》）和《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告 2014 年第 44 號(hào)）的相關(guān)要求。（二）主要原材料的研究資料應(yīng)提供主要原材料如引物、探針、企業(yè)參考品的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量分析和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究資料。若主要原材料為企業(yè)自己生產(chǎn)，其生產(chǎn)工藝必須相對(duì)穩(wěn)定，并提交工藝驗(yàn)證報(bào)告；如主要原材料購自其他供貨商，應(yīng)提供的資料包—5——括：供貨方提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢定報(bào)告，以及該原材料到貨后的質(zhì)量檢驗(yàn)資料。1.核酸分離純化組分（如有）的主要組成、原理介紹及相關(guān)的驗(yàn)證資料。2.PCR 組分的主要原料（包括引物、探針、各種酶及其他主要原料）的選擇、制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)研究資料，主要包括以下內(nèi)容：2.1 脫氧三磷酸核苷（dNTP）核酸的組成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP 和dTTP；應(yīng)提交對(duì)純度、濃度以及保存穩(wěn)定性等的驗(yàn)證資料。2.2 引物由一定數(shù)量的 dNTP 構(gòu)成的特定序列，通常采用 DNA 合成儀人工合成，合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化。需提供對(duì)分子量、純度、穩(wěn)定性以及功能性實(shí)驗(yàn)等的驗(yàn)證資料。如為外購，還應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如 PAGE 結(jié)果或高效液相色譜法（HPLC ）分析圖譜。2.3 探針特定的帶有示蹤物（標(biāo)記物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交，用于特定核酸序列的探測。合成后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）或其他適宜方法純化，在 5-端（和/ 或 3-端）進(jìn)行標(biāo)記，并經(jīng) HPLC 或其他適宜方法純化，純度應(yīng)達(dá)到 HPLC 純。應(yīng)提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成—6——產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如 HPLC 分析圖譜，應(yīng)對(duì)探針的分子量、純度及標(biāo)記的熒光素進(jìn)行核實(shí)，并進(jìn)行功能性試驗(yàn)驗(yàn)證。2.4 酶DNA 聚合酶，應(yīng)具有 DNA 聚合酶活性，無核酸內(nèi)切酶活性，具熱穩(wěn)定性，如：94℃保溫 1 小時(shí)后仍保持 50%活性；尿嘧啶 DNA 糖基化酶（UDG/UNG ），具有水解尿嘧啶糖苷鍵的活性，無核酸外切酶及核酸內(nèi)切酶活性。應(yīng)對(duì)酶活性進(jìn)行合理驗(yàn)證。3.核酸類檢測試劑的包裝材料和耗材應(yīng)無脫氧核糖核酸酶（DNase）污染。4.企業(yè)參考品：詳細(xì)說明企業(yè)參考品的原料選擇、制備和定值過程等試驗(yàn)資料。4.1 陽性參考品應(yīng)包括申報(bào)產(chǎn)品聲稱的全部突變類型。陽性參考品的突變類型需經(jīng)過金標(biāo)準(zhǔn)方法或已上市同類分型試劑的確認(rèn)。常見突變類型的陽性參考品至少有 1—2 種突變類型采用菌株，其他突變類型的陽性參考品可以采用含有突變的核酸（如：結(jié)核分枝桿菌基因組 DNA 或質(zhì)粒），不建議采用臨床樣本（如痰液）作為陽性參考品。注冊(cè)申請(qǐng)人可根據(jù)權(quán)威機(jī)構(gòu)的最新文件或文獻(xiàn)等確定常見突變類型，并提交相應(yīng)的支持資料。4.2 陰性參考品可采用經(jīng)確認(rèn)靶序列未發(fā)生突變的結(jié)核分枝桿菌菌株、申報(bào)產(chǎn)品聲稱的其他無關(guān)突變類型的核酸等。4.3 最低檢測限參考品—7——最低檢測限參考品須含有聲稱的所有突變類型。常見突變類型的最低檢測限參考品至少有 1—2 種突變類型采用菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1 陽性參考品”。4.4 精密度參考品精密度參考品至少應(yīng)包括弱陽性（低濃度突變型）水平，須含有申報(bào)產(chǎn)品聲稱的所有突變類型。常見突變類型的精密度參考品至少有 1—2 種突變類型采用菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1 陽性參考品 ”。對(duì)于 c 類 預(yù) 期 用 途 的 產(chǎn) 品 ， 申 請(qǐng) 人 應(yīng) 盡 可 能 對(duì) 國 內(nèi) 已 報(bào) 告的 耐 藥 核 酸 區(qū) 域 內(nèi) 的 常 見 突 變 類 型 設(shè) 置 上 述 各 種 類 型 的 企 業(yè) 參考 品 。 常 見 突 變 類 型 的 確 定 方 法 可 參 考 本 指 導(dǎo) 原 則 的 “4.1 陽 性參 考 品 ”。 對(duì) 于 利 福 平 耐 藥 基 因 突 變 檢 測 試 劑 ， 陽 性 參 考 品 、最 低 檢 測 限 參 考 品 以 及 精 密 度 參 考 品 至 少 應(yīng) 包 括 4—5 種 常 見突 變 類 型 ， 并 且 至 少 有 1—2 種 突 變 類 型 采 用 菌 株 。 對(duì) 于 其 他藥 物 的 耐 藥 基 因 突 變 檢 測 試 劑 ， 陽 性 參 考 品 、 最 低 檢 測 限 參 考品 以 及 精 密 度 參 考 品 至 少 應(yīng) 包 括 耐 藥 相 關(guān) 的 常 見 突 變 類 型 ， 并且 至 少 應(yīng) 有 1—2 種 突 變 類 型 采 用 菌 株 ， 突 變 類 型 的 數(shù) 量 可 根據(jù) 申 報(bào) 產(chǎn) 品 的 具 體 情 況 而 定 。5.試劑盒內(nèi)的對(duì)照申報(bào)產(chǎn)品的質(zhì)控體系通過設(shè)置各種對(duì)照來實(shí)現(xiàn)，以對(duì)樣本核酸分離純化、配液及加樣、試劑及儀器性能、擴(kuò)增反應(yīng)抑制—8——物（管內(nèi)抑制）、交叉污染和靶核酸降解等因素可能造成的假陰性或假陽性結(jié)果進(jìn)行合理質(zhì)控。申報(bào)資料應(yīng)詳細(xì)說明各種對(duì)照的原料選擇、制備和定值過程等。本指導(dǎo)原則的技術(shù)要求是基于熒光探針 PCR 方法建立的，對(duì)于采用該方法學(xué)的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測試劑，建議至少設(shè)置陽性對(duì)照、內(nèi)對(duì)照和陰性對(duì)照。5.1 陽性對(duì)照陽性對(duì)照可對(duì)實(shí)驗(yàn)過程進(jìn)行質(zhì)控。陽性對(duì)照可采用菌株、質(zhì)粒或基因組提取物等。企業(yè)應(yīng)對(duì)陽性對(duì)照相應(yīng)判斷數(shù)值做出明確要求。5.2 內(nèi)對(duì)照內(nèi)對(duì)照可對(duì)實(shí)驗(yàn)過程的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制。內(nèi)對(duì)照可采用質(zhì)?；蚓€性 DNA 等。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)內(nèi)對(duì)照的引物、探針和模板濃度做精確的驗(yàn)證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性又要盡量降低對(duì)靶核酸序列檢測造成的抑制而導(dǎo)致假陰性。企業(yè)應(yīng)對(duì)內(nèi)對(duì)照或相應(yīng)判斷數(shù)值做出明確要求。5.3 陰性對(duì)照陰性對(duì)照可采用含有野生型靶序列的核酸或空白對(duì)照，以對(duì)交叉污染造成的假陽性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。陰性對(duì)照需參與樣本核酸的平行提取純化。由于申報(bào)產(chǎn)品所適用的臨床樣本比較復(fù)雜，其中可能含有各種影響 PCR 反應(yīng)的抑制物，造成假陰性。因此，申報(bào)產(chǎn)品應(yīng)充分考慮對(duì)樣本核酸提取純化環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制，通過設(shè)置各種—9——對(duì)照進(jìn)行質(zhì)控。比如，采用克隆菌株作為內(nèi)對(duì)照或陽性對(duì)照并參與樣本核酸的平行提取純化，或者設(shè)置專門的核酸提取純化對(duì)照（如菌株）等，以對(duì)樣本核酸提取純化的質(zhì)量及效率進(jìn)行評(píng)估。（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料應(yīng)能對(duì)反應(yīng)體系涉及到的基本內(nèi)容，如臨床樣本用量、試劑用量、反應(yīng)條件和質(zhì)控體系設(shè)置等，提供確切的依據(jù)，配制工作液的各種原材料及其配比應(yīng)符合要求，原材料應(yīng)混合均勻，配制過程應(yīng)對(duì) pH、電導(dǎo)率、離子濃度等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行有效控制。主要包括以下內(nèi)容：1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可以圖表方式表示。2.確 定 最 佳 PCR 反 應(yīng) 體 系 的 研 究 資 料 ， 包 括 酶 濃 度 、 引物 /探 針 濃 度 、 dNTP 濃 度 以 及 陽 離 子 濃 度 等 。3.PCR 反應(yīng)各階段溫度、時(shí)間及循環(huán)數(shù)的研究資料。4.對(duì)于基線閾值和閾值循環(huán)數(shù)等確定的研究資料。5.如申報(bào)產(chǎn)品包含核酸提取純化試劑，應(yīng)提交對(duì)核酸提取純化過程進(jìn)行工藝優(yōu)化的研究資料。（四）分析性能評(píng)估資料申請(qǐng)人應(yīng)提交對(duì)申報(bào)產(chǎn)品進(jìn)行的所有性能驗(yàn)證的研究資料，包括具體試驗(yàn)方法、內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)資料。該類產(chǎn)品建議著重對(duì)以下分析性能進(jìn)行研究。1.陽性/陰性參考品符合率各突變類型的陽性參考品均應(yīng)檢出陽性/耐藥，陰性參考品—10——應(yīng)檢測為陰性/敏感。其中，常見突變類型至少有 1—2 種突變類型采用耐藥菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸樣本。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1 陽性參考品” 。2.最低檢測限建議采用 95%（n≥20）的陽性檢出率作為最低檢測限確定的標(biāo)準(zhǔn)。擴(kuò)增反應(yīng)終體系中的突變序列百分率和總核酸濃度兩個(gè)因素對(duì)最低檢測限的影響較大，終體系中突變序列的百分率越高、所含的 DNA 量越多，則越容易檢出。而終體系中的這兩個(gè)因素是由臨床樣本中的結(jié)核分枝桿菌耐藥菌與野生菌的含量和相對(duì)比例決定的。因此，需從以下兩個(gè)方面考察申報(bào)產(chǎn)品的最低檢測限。2.1 100%耐藥比例下，耐藥菌株/ 突變核酸的最低檢測濃度將結(jié) 核 分 枝 桿 菌 耐 藥 菌 株 /突 變 核 酸 進(jìn) 行 系 列 稀 釋 ， 制 備 不同 濃 度 的 耐 藥 菌 株 /突 變 核 酸 樣 本 。 其 中 ， 常 見 突 變 類 型 至 少 有1—2 種 突 變 類 型 采 用 耐 藥 菌 株 ， 其 他 突 變 類 型 可 采 用 含 有 相 應(yīng)突 變 的 核 酸 樣 本 （ 如 ： 質(zhì) 粒 或 基 因 組 DNA） 。 常 見 突 變 類 型的 確 定 方 法 可 參 考 本 指 導(dǎo) 原 則 的 “4.1 陽 性 參 考 品 ”。分別對(duì)各濃度樣本進(jìn)行不少于 20 次的重復(fù)檢測，確定 95%陽性檢出率水平，作為可檢測的最低耐藥菌株/突變核酸濃度。2.2 不同菌株/核酸濃度、各種耐藥比例的最低檢測限。配制不同菌株/核酸濃度、各種耐藥比例的混合液：將不同濃度的結(jié)核分枝桿菌野生菌株和耐藥菌株進(jìn)行混合，調(diào)整野生—11——和耐藥菌株的比例，得到含不同菌株濃度和各種耐藥比例的菌株混合液?；蛘?，將不同濃度的野生質(zhì)粒和突變質(zhì)粒進(jìn)行混合，調(diào)整野生質(zhì)粒和突變質(zhì)粒的比例，得到含不同核酸濃度和各種耐藥比例的核酸混合液。其中，常見突變類型至少有 1—2 種突變類型采用耐藥菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸樣本（如：質(zhì)?；蚧蚪M DNA）。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1 陽性參考品” 。對(duì)各份混合液進(jìn)行不少于 20 次的重復(fù)檢測，確定 95%陽性檢出率水平，作為不同菌株/核酸濃度、各種耐藥比例的最低檢測限。為確定痰樣本的最低檢測限，建議將至少 1 株結(jié)核分枝桿菌耐藥/敏感菌株、結(jié)核分枝桿菌陰性的痰樣本進(jìn)行混合，完全按照申報(bào)產(chǎn)品的操作步驟對(duì)此“制備痰液 ”進(jìn)行樣本前處理、核酸提取純化和擴(kuò)增等。對(duì)結(jié)核分枝桿菌陰性痰樣本的確認(rèn)，應(yīng)采用涂片、培養(yǎng)鑒定、臨床診斷和其他已上市的核酸檢測試劑盒進(jìn)行聯(lián)合確認(rèn)。應(yīng)明確每種菌株/核酸的來源、突變類型、濃度和制備方法等信息。企業(yè)可采用適宜方法進(jìn)行菌株濃度的確認(rèn)，可采用鋪板計(jì)數(shù)細(xì)菌集落形成單位（colony forming unit，CFU）的方法進(jìn)行菌株濃度的確認(rèn)，以 CFU/mL 作為菌株濃度的表示方式；也可采用國家參考品對(duì)菌株濃度進(jìn)行標(biāo)定，以“個(gè)菌/mL” 作為菌株濃度的表示方式。—12——3.分析特異性3.1 野生型驗(yàn)證：采用不同濃度的野生型結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果應(yīng)為敏感或陰性。3.2 申報(bào)產(chǎn)品聲稱的全部突變類型間的交叉反應(yīng)驗(yàn)證。3.3 對(duì)于痰等復(fù)雜的臨床樣本類型，鑒于可檢測樣本中可能同時(shí)含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，為了驗(yàn)證非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群等其他病原體對(duì)申報(bào)產(chǎn)品的檢測結(jié)果是否造成假陰性和假陽性結(jié)果，需對(duì)核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他病原體進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。用于交叉反應(yīng)研究的其他分枝桿菌具體包括：堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、土地分枝桿菌、次要分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、戈登分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、鳥分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、偶然分枝桿菌、胃分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、草分枝桿菌。上述細(xì)菌均應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。用于交叉反應(yīng)研究的其他病原體具體包括：肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌、隱球菌、金黃色葡萄球菌、諾卡氏菌、綠膿桿菌、白色念珠菌。上述病原體均應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)于培養(yǎng)物樣本類型，3.3 項(xiàng)不適用。4.干擾物質(zhì)4.1 潛 在 干 擾 物 質(zhì) 主 要 包 括 ： 內(nèi) 源 性 物 質(zhì) （ 不 含 待 檢 野 生 /突—13——變 靶 標(biāo) 的 相 應(yīng) 臨 床 樣 本 ） 和 外 源 性 藥 物 。 建 議 使 用 醫(yī) 學(xué) 相 關(guān) 水平 的 干 擾 物 濃 度 進(jìn) 行 驗(yàn) 證 。 建 議 申 請(qǐng) 人 在 每 種 干 擾 物 質(zhì) 的 潛 在最 大 濃 度 （ 最 差 條 件 ） 條 件 下 進(jìn) 行 評(píng) 價(jià) 。 對(duì) 于 常 見 藥 物 干 擾 試驗(yàn) ， 建 議 參 照 相 應(yīng) 藥 物 藥 代 動(dòng) 力 學(xué) 研 究 確 定 的 治 療 藥 物 濃 度 添加 相 應(yīng) 藥 物 進(jìn) 行 干 擾 驗(yàn) 證 。 具 體 目 錄 參 見 表 3。用于干擾研究的外源性藥物具體包括：異煙肼、利福平、抗生素（如：阿莫西林、左氧氟沙星）、鼻腔噴霧劑或滴鼻劑（如：腎上腺素、羥甲唑啉、含防腐劑的氯化鈉溶液）、鼻用軟膏類（如：莫匹羅星）、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、抗病毒藥（如：扎那米韋）、鼻腔糖皮質(zhì)激素（如：倍氯米松、地塞米松、氟尼縮松、曲安西龍、布地奈德、莫美他松、氟替卡松）。上述外源性藥物均應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證，括號(hào)內(nèi)至少選做一種。對(duì)于培養(yǎng)物樣本類型，4.1 項(xiàng)不適用。4.2 對(duì)于培養(yǎng)物樣本，干擾物質(zhì)主要為適用培養(yǎng)基和相關(guān)藥物的干擾，應(yīng)在最低檢測限濃度/陰性條件下驗(yàn)證相關(guān)藥物和培養(yǎng)基對(duì)檢測結(jié)果的影響，明確不產(chǎn)生干擾的最大培養(yǎng)基和藥物濃度。5.精密度測量精密度的評(píng)價(jià)方法并無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)可依，可根據(jù)不同產(chǎn)品特征或企業(yè)的研究習(xí)慣進(jìn)行，前提是必須保證研究的科學(xué)合理性。具體實(shí)驗(yàn)方法可以參考國內(nèi)或國外的相關(guān)文件進(jìn)行。企業(yè)應(yīng)對(duì)每項(xiàng)精密度指標(biāo)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。針對(duì)申報(bào)產(chǎn)品的精密度評(píng)價(jià)主要包括以下要求。—14——5.1 對(duì)可能影響檢測精密度的主要變量進(jìn)行驗(yàn)證，除申報(bào)產(chǎn)品（包括提取純化組分和 PCR 組分）本身的影響外，還應(yīng)對(duì)不同的適用機(jī)型（如 PCR 分析儀）、操作者和地點(diǎn)等要素進(jìn)行相關(guān)的驗(yàn)證。5.2 合理的精密度評(píng)價(jià)周期，例如：為期至少 12 天的檢測，每天至少由 2 人完成不少于 2 次的完整檢測，從而對(duì)批內(nèi)/批間、日內(nèi)/ 日間以及不同操作者之間的精密度進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。如有條件，申請(qǐng)人應(yīng)選擇不同的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)以對(duì)室間精密度進(jìn)行評(píng)價(jià)。5.3 建議在以下 3 個(gè)濃度進(jìn)行驗(yàn)證：5.3.1 陰性樣本：靶序列未發(fā)生突變的結(jié)核分枝桿菌野生型菌株，陰性檢出率應(yīng)為 100%（n≥20）。5.3.2 弱陽 性 樣 本 ： 耐 藥 菌 株 /突 變 核 酸 濃 度 略 高 于 申 報(bào) 產(chǎn) 品的 最 低 檢 測 限 ， 陽 性 檢 出 率 應(yīng) 高 于 95%（ n≥ 20） 。 （ 弱 陽 性 樣本 應(yīng) 包 括 申 報(bào) 產(chǎn) 品 聲 稱 的 所 有 突 變 類 型 。 常 見 突 變 類 型 至 少 有1—2 種 突變類型采用耐藥菌株，其他突變類型可采用含有突變的核酸樣本。 ）5.3.3 中等陽性樣本：耐藥菌株/突變核酸濃度約為最低檢測限的 2 倍或 3 倍，陽性檢出率為 100%且 CV≤15%（n≥20）。（可選擇申報(bào)產(chǎn)品聲稱的部分突變類型進(jìn)行驗(yàn)證，但至少應(yīng)包括 1 株結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株。 ）6.不同樣本前處理方法和核酸提取純化方法的分析性能資料要求—15——如果 某 種 樣 本 類 型 可 采 用 幾 種 方 法 進(jìn) 行 樣 本 前 處 理 （ 如 ：痰 /痰 沉 淀 物 ） ， 申 請(qǐng) 人 應(yīng) 提 交 適 用 的 樣 本 前 處 理 方 法 （ 進(jìn) 行 全項(xiàng) 目 分 析 性 能 評(píng) 估 的 樣 本 前 處 理 方 法 除 外 ） 與 后 續(xù) 試 驗(yàn) 配 合 進(jìn)行 的 性 能 試 驗(yàn) （ 至 少 包 括 最 低 檢 測 限 項(xiàng) 目 ） ， 以 證 明 不 同 的 樣本 前 處 理 方 法 不 影 響 檢 測 結(jié) 果 。如果某種樣本類型可采用幾種方法進(jìn)行核酸提取純化，申請(qǐng)人應(yīng)提供適用的核酸提取純化方法（進(jìn)行全項(xiàng)目分析性能評(píng)估的核酸提取純化方法除外）與后續(xù)試驗(yàn)配合進(jìn)行的性能試驗(yàn)（至少包括最低檢測限和精密度項(xiàng)目），以證明不同的核酸提取純化方法不影響檢測結(jié)果。對(duì)于 c 類預(yù)期用途的產(chǎn)品，申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)國內(nèi)已報(bào)告的耐藥核酸區(qū)域內(nèi)的常見突變類型進(jìn)行上述分析性能項(xiàng)目的驗(yàn)證。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1 陽性參考品” 。對(duì)于利福平耐藥基因突變檢測試劑，陽性符合率、最低檢測限以及精密度試驗(yàn)至少應(yīng)包括 4—5 種常見突變類型，并且至少有1—2 種突變類型采用菌株。對(duì)于其他藥物的耐藥基因突變檢測試劑，陽性符合率、最低檢測限以及精密度試驗(yàn)至少應(yīng)包括耐藥相關(guān)的常見突變類型，并且至少應(yīng)有 1—2 種突變類型采用菌株，突變類型的數(shù)量可根據(jù)申報(bào)產(chǎn)品的具體情況而定。對(duì)于適用多個(gè)機(jī)型的產(chǎn)品，應(yīng)提供如產(chǎn)品說明書【適用儀器】項(xiàng)中所列的所有型號(hào)儀器的至少三批全性能評(píng)估資料。（五）陽性判斷值確定資料對(duì)于此類試劑，陽性判斷值確定資料主要是指 Ct 值/Ct 值—16——的差值/熒光信號(hào)差值等的確認(rèn)資料，建議申請(qǐng)人采用受試者工作特征（ROC ）曲線的方式對(duì)申報(bào)產(chǎn)品用于結(jié)果判斷的臨界值予以確認(rèn)。有關(guān) ROC 曲線分析的細(xì)節(jié)，請(qǐng)參考國內(nèi)外相關(guān)的文件。如存在灰區(qū)，應(yīng)提交灰區(qū)上下限確定的詳細(xì)研究資料。（六）穩(wěn)定性研究資料穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報(bào)產(chǎn)品的穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性。前者主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、開瓶穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請(qǐng)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實(shí)施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究資料。另外，還應(yīng)提供樣本保存條件、保存時(shí)間等方面的詳細(xì)研究資料。樣本穩(wěn)定性研究主要包括核酸分離純化前樣本穩(wěn)定性和分離純化后核酸在儲(chǔ)備液中的穩(wěn)定性兩方面。在合理的溫度范圍內(nèi)選擇多個(gè)溫度點(diǎn)（應(yīng)至少包括范圍的上限和下限溫度），每間隔一定的時(shí)間段對(duì)儲(chǔ)存樣本進(jìn)行分析驗(yàn)證，從而確認(rèn)不同類型樣本的穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對(duì)凍融次數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。（七）臨床試驗(yàn)研究1.臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的選擇申請(qǐng)人應(yīng)當(dāng)選定不少于 3 家（含 3 家）臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，按照相關(guān)規(guī)定開展臨床試驗(yàn)。申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)及其預(yù)期用—17——途，綜合不同地區(qū)人種、流行病學(xué)背景和病原微生物的特性等因素選擇臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)。2.臨床 試 驗(yàn) 人 群 ： 對(duì) 于 僅 進(jìn) 行 結(jié) 核 分 枝 桿 菌 復(fù) 合 群 耐 藥 基因 突 變 檢 測 的 單 功 能 試 劑 ， 選 擇 結(jié) 核 病 患 者 進(jìn) 行 臨 床 試 驗(yàn) ； 對(duì)于 同 一 注 冊(cè) 單 元 內(nèi) 可 同 時(shí) 進(jìn) 行 結(jié) 核 分 枝 桿 菌 復(fù) 合 群 核 酸 檢 測 以及 耐 藥 基 因 突 變 檢 測 的 雙 功 能 試 劑 ， 盡 管 其 核 酸 檢 測 部 分 的 適用 人 群 為 疑 似 結(jié) 核 病 患 者 ， 但 只 有 核 酸 陽 性 才 能 進(jìn) 行 下 一 步 的耐 藥 基 因 突 變 檢 測 ， 因 此 其 耐 藥 基 因 突 變 檢 測 部 分 的 適 用 人 群為 結(jié) 核 病 患 者 。3.臨床樣本的要求：進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測的臨床樣本應(yīng)為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的樣本。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的確認(rèn)方法同本指導(dǎo)原則“二范圍” 第 3 條。4.臨床試驗(yàn)樣本量鑒于痰、支氣管肺泡灌洗液以及培養(yǎng)物等樣本之間差異較大，如果申報(bào)產(chǎn)品同時(shí)適用于上述幾種樣本類型，每種樣本類型的例數(shù)不少于 500 例。如果申報(bào)產(chǎn)品適用于某種樣本類型的液體培養(yǎng)物和固體培養(yǎng)物，應(yīng)進(jìn)行不少于 150 例液體和固體培養(yǎng)物的同源比對(duì)試驗(yàn)（應(yīng)包括一定數(shù)量的陽性和陰性樣本），證明不同的培養(yǎng)物不會(huì)影響檢測結(jié)果。如果某種樣本類型適用于幾種樣本前處理方法，應(yīng)進(jìn)行不少于 150 例樣本的同源比對(duì)試驗(yàn)（應(yīng)包括一定數(shù)量的陽性和陰—18——性樣本），證明不同的樣本前處理方法不會(huì)影響檢測結(jié)果。如果某種樣本類型適用于幾種核酸提取純化方法，應(yīng)進(jìn)行不少于 150 例樣本的同源比對(duì)試驗(yàn)（應(yīng)包括一定數(shù)量的陽性和陰性樣本），證明不同的核酸提取純化方法不會(huì)影響檢測結(jié)果。臨床試驗(yàn)應(yīng)盡量采用新鮮樣本，如采用凍存樣本應(yīng)另行說明。5.對(duì)比試劑5.1 對(duì)于已有同類產(chǎn)品上市的申報(bào)產(chǎn)品如果選擇已上市同類產(chǎn)品或基因測序作為對(duì)比試劑，還需選擇至少 200 例樣本（敏感和耐藥分別至少 100 例）進(jìn)行傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)（金標(biāo)準(zhǔn)）的驗(yàn)證。對(duì)于 c 類產(chǎn)品，除了還需選擇至少 200 例樣本（敏感和耐藥分別至少 100 例）進(jìn)行傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)（金標(biāo)準(zhǔn)）的驗(yàn)證外，還需對(duì)所有耐藥/陽性樣本采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行驗(yàn)證，以明確引起耐藥/陽性的具體突變類型。如果選擇傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)（金標(biāo)準(zhǔn)）作為對(duì)比方法，還需對(duì)所有耐藥/陽性樣本采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行驗(yàn)證，以明確引起耐藥的具體突變類型。5.2 對(duì)于新的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測試劑對(duì)于新的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測試劑，選擇傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)方法（金標(biāo)準(zhǔn)）和基因測序作為對(duì)比試劑。5.3 陽性樣本例數(shù)的要求—19——對(duì)于 a 類和 b 類產(chǎn)品，產(chǎn)品預(yù)期用途中聲稱的每種突變類型均應(yīng)具有一定的陽性例數(shù)，每種突變類型均應(yīng)分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于 c 類產(chǎn)品，應(yīng)盡量對(duì)檢測靶核酸區(qū)域內(nèi)的常見突變類型進(jìn)行驗(yàn)證。有關(guān)測序方法的相關(guān)要求，請(qǐng)參考《結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑技術(shù)審查指導(dǎo)原則》相關(guān)要求以及現(xiàn)行法規(guī)要求。6.臨床試驗(yàn)方法、數(shù)據(jù)及統(tǒng)計(jì)分析6.1 應(yīng)在臨床試驗(yàn)方案或者臨床試驗(yàn)報(bào)告中詳細(xì)描述申報(bào)產(chǎn)品和對(duì)比試劑的具體操作步驟。6.2 臨床試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)應(yīng)以列表的方式表示，包括樣本的申報(bào)產(chǎn)品的結(jié)果、對(duì)比試劑的結(jié)果、藥敏結(jié)果以及耐藥比例和臨床診斷（如：何種結(jié)核?。┑取?.3 對(duì)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)應(yīng)選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法，如檢測結(jié)果一致性分析、受試者工作特征（ROC）曲線分析、陰性/ 陽性符合率等。6.4 對(duì)于申報(bào)產(chǎn)品與對(duì)比試劑（對(duì)比方法）的等效性評(píng)價(jià)，常選擇交叉四格表形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行四格表卡方或 kappa 檢驗(yàn)以驗(yàn)證兩種試劑定性結(jié)果的一致性，統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)可以證明兩種方法的檢測結(jié)果無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在臨床試驗(yàn)方案中應(yīng)明確統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)假設(shè)，即評(píng)價(jià)申報(bào)產(chǎn)品與對(duì)比試劑（對(duì)比方法）是否等效的標(biāo)準(zhǔn)。6.5 結(jié)果差異樣本的驗(yàn)證—20——在數(shù)據(jù)收集過程中，對(duì)于兩種試劑檢測結(jié)果不一致的樣本，應(yīng)采用金標(biāo)準(zhǔn)（測序或藥敏試驗(yàn)）或其他合理方法進(jìn)行復(fù)核，同時(shí)結(jié)合患者的臨床病情對(duì)差異原因及可能結(jié)果進(jìn)行分析。如無需復(fù)核，應(yīng)詳細(xì)說明理由。7.臨床試驗(yàn)方案臨床試驗(yàn)實(shí)施前，研究者應(yīng)從流行病學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)等多方面考慮，設(shè)計(jì)科學(xué)合理的臨床試驗(yàn)方案。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的方案設(shè)置應(yīng)基本一致，且保證在整個(gè)臨床試驗(yàn)過程中遵循預(yù)定的方案實(shí)施，不可隨意改動(dòng)。整個(gè)試驗(yàn)過程應(yīng)在臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)并由本實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員操作完成，申報(bào)單位的技術(shù)人員除進(jìn)行必要的技術(shù)指導(dǎo)外，不得隨意干涉實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，尤其是數(shù)據(jù)收集過程。試驗(yàn)方案中應(yīng)確定嚴(yán)格的樣本入選/排除標(biāo)準(zhǔn)，任何已經(jīng)入選的樣本再被排除出臨床試驗(yàn)都應(yīng)記錄在案并明確說明原因。在試驗(yàn)操作過程中和判定試驗(yàn)結(jié)果時(shí)應(yīng)采用盲法以保證試驗(yàn)結(jié)果的客觀性。各臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)選用的對(duì)比試劑應(yīng)保持一致，以便進(jìn)行合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。另外，申報(bào)產(chǎn)品的樣本類型不應(yīng)超越對(duì)比試劑對(duì)樣本類型的要求。8.臨床試驗(yàn)報(bào)告的撰寫根據(jù)《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求，臨床試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)對(duì)試驗(yàn)的整體設(shè)計(jì)及各個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)給予清晰、完整的闡述，應(yīng)該對(duì)整個(gè)臨床試驗(yàn)實(shí)施過程、結(jié)果分析、結(jié)論等進(jìn)行條理分明的描述，并應(yīng)包括必要的數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析方法。建—21——議在臨床試驗(yàn)報(bào)告中對(duì)以下內(nèi)容進(jìn)行詳述。8.1 臨床試驗(yàn)總體設(shè)計(jì)及方案描述8.1.1 臨床試驗(yàn)的整體管理情況、臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)選擇、臨床主要研究人員簡介等基本情況介紹。8.1.2 病例的納入/排除標(biāo)準(zhǔn)。8.1.3 樣本類型，樣本的收集、處理及保存；培養(yǎng)、鑒定、藥敏方法等。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的確認(rèn)方法，如采用已獲國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)上市的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑作為確認(rèn)方法，應(yīng)明確生產(chǎn)廠家和醫(yī)療器械注冊(cè)證號(hào)等相關(guān)信息；如采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法作為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的確認(rèn)方法，應(yīng)詳細(xì)說明培養(yǎng)方法和鑒定方法。8.1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法、統(tǒng)計(jì)軟件、評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)。8.2 具體臨床試驗(yàn)情況8.2.1 申報(bào)產(chǎn)品和對(duì)比試劑的名稱、批號(hào)、有效期及所用機(jī)型等信息。8.2.2 對(duì)各試驗(yàn)機(jī)構(gòu)的病例數(shù)等情況進(jìn)行總合，建議以列表或圖示方式給出具體例數(shù)及百分比。8.2.3 質(zhì)量控制，試驗(yàn)人員培訓(xùn)、儀器日常維護(hù)、質(zhì)控品運(yùn)行情況，對(duì)檢測精密度、質(zhì)控品測量值的抽查結(jié)果評(píng)估。8.2.4 具體試驗(yàn)過程，樣本檢測、數(shù)據(jù)收集、樣本的保存條件、結(jié)果不一致樣本的校驗(yàn)等。8.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析8.3.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異數(shù)據(jù)的重新檢測或其他合理方法的—22——復(fù)核以及是否納入最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、對(duì)異常值或缺失值的處理、研究過程中是否涉及對(duì)方案的修改。8.3.2 陽性符合率、陰性符合率、總體符合率及其 95%（或99%）的置信區(qū)間。8.3.3 以交叉表的形式總結(jié)兩種試劑的定性檢測結(jié)果，對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行四格表卡方或 kappa 檢驗(yàn)以驗(yàn)證兩種試劑定性結(jié)果的一致性。8.4 討論和結(jié)論對(duì)總體結(jié)果進(jìn)行總結(jié)性描述并簡要分析試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)本次臨床試驗(yàn)有無特別說明，最后得出臨床試驗(yàn)結(jié)論。（八）產(chǎn)品說明書產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，境外試劑的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書一致，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請(qǐng)人提交的其他注冊(cè)申報(bào)資料保持一致，如某些內(nèi)容引自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)采用規(guī)范格式對(duì)此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。結(jié)合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，下面對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群耐藥基因突變檢測試劑說明書的重點(diǎn)內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說明，以指導(dǎo)注冊(cè)申報(bào)人員合理編制說明書。1.【預(yù)期用途】應(yīng)至少包括以下幾部分內(nèi)容：1.1 根據(jù)【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】的結(jié)果報(bào)告形式， 【預(yù)期用途】第一段可表述為以下幾種情況：—23——1.1.1 申報(bào)產(chǎn)品可區(qū)分具體突變類型，結(jié)果報(bào)告具體突變類型（a 類） 。建議表述為：本產(chǎn)品用于體外定性檢測來自結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的 xx 樣本中的 yy 耐藥基因突變，可檢測的突變類型包括 zz，本產(chǎn)品可區(qū)分具體突變類型。本產(chǎn)品用于對(duì)某種（類）藥物耐藥的耐藥結(jié)核病的輔助診斷。1.1.2 已知申報(bào)產(chǎn)品可檢測的具體突變類型（如：針對(duì)具體突變類型設(shè)計(jì)特異突變探針，從檢驗(yàn)原理上已知可檢測哪些突變類型） ，但結(jié)果不區(qū)分具體突變類型，結(jié)果報(bào)告為耐藥/敏感等（b 類） 。建議表述為：本產(chǎn)品用于體外定性檢測來自結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的 xx 樣本中的 yy 耐藥基因突變，可檢測的突變類型包括 zz，本產(chǎn)品不區(qū)分具體突變類型。本產(chǎn)品用于對(duì)某種（類）藥物耐藥的耐藥結(jié)核病的輔助診斷。1.1.3 某段核酸區(qū)域的突變可導(dǎo)致對(duì)某種藥物耐藥，申報(bào)產(chǎn)品從檢驗(yàn)原理上沒有必要明確具體突變類型，結(jié)果報(bào)告為耐藥/敏感（c 類） 。建議表述為：本產(chǎn)品用于體外定性檢測來自結(jié)核病患者的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的 xx 樣本中的 yy 耐藥，本產(chǎn)品無法明確具體突變類型。本產(chǎn)品用于對(duì)某種（類）藥物耐藥的耐藥結(jié)核病的輔助診斷。需要特別注意如下幾點(diǎn)：1.b 類預(yù)期用途的試劑所包括的突變類型對(duì)同一種（類）藥物必須具有相同的指導(dǎo)用藥的臨床意義。2.對(duì)于 c 類預(yù)期用途的試劑，申請(qǐng)人必須有充分可靠的科學(xué)證據(jù)證明某段核酸區(qū)域與某種（類）藥物具有明確的臨床意—24——義。申請(qǐng)人必須提供科學(xué)權(quán)威的支持資料，證明：耐藥基因區(qū)域的突變可引起耐藥；耐藥基因區(qū)域的突變對(duì)同一種（類）藥物必須具有相同的指導(dǎo)用藥的臨床意義。申請(qǐng)人還應(yīng)提交耐藥基因區(qū)域內(nèi)所有堿基在國內(nèi)外的突變頻率。1.2 介紹與耐藥相關(guān)的檢測靶標(biāo)、檢測靶標(biāo)的突變位點(diǎn)和突變類型（如適用） ；明確申報(bào)產(chǎn)品可檢測的突變類型或耐藥核酸區(qū)域?qū)е碌谋硇湍退幷寂R床所有表型耐藥的比例。1.3 適用人群：結(jié)核病患者。特別注意的是，對(duì)于同一注冊(cè)單元內(nèi)可同時(shí)進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測以及耐藥基因突變檢測的雙功能試劑，盡管其核酸檢測部分的適用人群為疑似結(jié)核病患者，但只有核酸陽性才能進(jìn)行下一步的耐藥基因突變檢測，因此其耐藥基因突變檢測部分的適用人群為結(jié)核病患者。1.4 明確臨床試驗(yàn)驗(yàn)證過的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群陽性的確認(rèn)方法的相關(guān)信息。2.【主要組成成分】2.1 說明試劑盒包含組分的名稱、數(shù)量、比例或濃度等信息，說明不同批號(hào)試劑盒中各組分是否可以互換。2.2 試劑盒中不包含但對(duì)該項(xiàng)檢測必須的組份，企業(yè)應(yīng)列出相關(guān)試劑/耗材的名稱、貨號(hào)及其他相關(guān)信息。2.3 如果試劑盒中不包含用于核酸提取純化的試劑組份，則應(yīng)在此注明經(jīng)過驗(yàn)證后配合使用的商品化核酸提取純化試劑盒的生產(chǎn)企業(yè)、產(chǎn)品名稱以及產(chǎn)品貨號(hào)和醫(yī)療器械備案號(hào)（如有）—25——等詳細(xì)信息。3.【檢驗(yàn)原理】3.1 對(duì)試劑盒檢測靶標(biāo)以及突變類型（如適用）進(jìn)行詳細(xì)描述（基因名稱和基因位置、靶序列長度、突變類型（如適用）及相關(guān)特征等） ，對(duì)試劑盒所用探針、引物、突變或耐藥的判定終點(diǎn)等進(jìn)行詳細(xì)的介紹；對(duì)不同樣品反應(yīng)管組合、對(duì)照設(shè)置及熒光信號(hào)檢測原理等進(jìn)行介紹。3.2 試劑盒技術(shù)原理的詳細(xì)介紹，建議結(jié)合適當(dāng)圖示進(jìn)行說明。如反應(yīng)體系中添加了相關(guān)的防污染組分（如 UNG 酶） ，也應(yīng)對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行適當(dāng)介紹。4.【儲(chǔ)存條件及有效期】說明試劑盒的效期穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、復(fù)溶穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性和凍融次數(shù)要求等，應(yīng)明確具體的儲(chǔ)存條件及有效期。5.【樣本要求】重點(diǎn)明確以下內(nèi)容：5.1 臨床樣本的收集：建議參照《臨床技術(shù)操作規(guī)范（結(jié)核病分冊(cè)） 》 （中華醫(yī)學(xué)會(huì)編著）或者《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》 （中國防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì)編著）現(xiàn)行有效版本推薦的采樣要求或國外的同類文件，并詳細(xì)描述采樣步驟和注意事項(xiàng)。5.2 臨床樣本的前處理：建議參考《臨床技術(shù)操作規(guī)范（結(jié)核病分冊(cè)） 》 （中華醫(yī)學(xué)會(huì)編著）或者《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》 （中國防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì)編著）現(xiàn)行有效版本推薦—26——的前處理方法或國外的同類文件，詳細(xì)描述具體的前處理方法。5.3 培養(yǎng)物樣本：詳細(xì)描述培養(yǎng)鑒定方法，包括：從患者采集的臨床樣本類型、樣本采集后處理、所用培養(yǎng)基、相關(guān)藥物和具體操作步驟等、申報(bào)產(chǎn)品從培養(yǎng)物中取樣進(jìn)行檢測的時(shí)間點(diǎn)、取樣方法和對(duì)培養(yǎng)物樣本的處理等。5.4 樣本的其他處理、運(yùn)送和保存：明確核酸提取純化前的其他處理（如離心和洗滌等） 、保存條件及期限（短期和長期）以及運(yùn)送條件等。冷藏/冷凍樣本檢測前是否需要恢復(fù)至室溫，凍融次數(shù)的限制等。6.【適用儀器】所有適用的儀器型號(hào)，并提供與儀器有關(guān)的重要信息以指導(dǎo)用戶操作。7.【檢驗(yàn)方法】詳細(xì)說明實(shí)驗(yàn)操作的各個(gè)步驟，包括：7.1 實(shí)驗(yàn)條件：實(shí)驗(yàn)室分區(qū)、實(shí)驗(yàn)環(huán)境的溫度、濕度和空調(diào)氣流方向控制等注意事項(xiàng)。7.2 試劑配制方法和注意事項(xiàng)。7.3 詳述待測樣本及相關(guān)對(duì)照核酸提取純化的條件、步驟及注意事項(xiàng)（如適用） 。7.4 擴(kuò)增反應(yīng)前準(zhǔn)備：加樣體積、順序等。7.5 PCR 各階段的溫度、時(shí)間設(shè)置、循環(huán)數(shù)設(shè)置或相應(yīng)的自動(dòng)化檢測程序及相關(guān)注意事項(xiàng)。7.6 儀器設(shè)置（如適用）：特殊參數(shù)、探針的熒光素標(biāo)記情況、對(duì)待測突變及內(nèi)標(biāo)和其他對(duì)照的熒光通道選擇等?！?7——8.【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】結(jié)合陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、內(nèi)對(duì)照、核酸提取純化對(duì)照（如適用） 、樣本管檢測結(jié)果以及已驗(yàn)證的突變類型與耐藥之間的關(guān)系，以列表的形式詳述所有可能出現(xiàn)的結(jié)果及相應(yīng)的解釋。如存在檢測灰區(qū)（如：耐藥不確定等） ，應(yīng)詳述對(duì)于灰區(qū)結(jié)果的處理方式。9.【檢驗(yàn)方法的局限性】9.1 申報(bào)產(chǎn)品僅對(duì)下述突變類型 xx 進(jìn)行了驗(yàn)證。對(duì)于 c 類產(chǎn)品，在此處明確境內(nèi)臨床試驗(yàn)做過驗(yàn)證的突變類型。9.2 申報(bào)產(chǎn)品的檢測結(jié)果僅作為初篩結(jié)果，僅供臨床參考，用于輔助診斷結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的耐藥性，不應(yīng)作為患者耐藥的確診依據(jù)。臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情、藥物適應(yīng)癥、療效及其他實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)等因素對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。9.3 本產(chǎn) 品 僅 檢 測 靶 標(biāo) 區(qū) 域 內(nèi) 突 變 引 起 的 耐 藥 。 由 其 他 基因 或 基 因 區(qū) 域 的 突 變 、 以 及 其 他 耐 藥 機(jī) 制 引 起 的 耐 藥 本 產(chǎn) 品 不能 檢 出 。9.4 本產(chǎn)品不能用于監(jiān)測患者對(duì)于抗生素的治療進(jìn)展以及成功與否，因?yàn)榻?jīng)過抗菌治療后，細(xì)菌 DNA 可能仍舊存在。9.5 有關(guān)假陰性結(jié)果的可能性分析9.5.1 不合理的樣本采集、運(yùn)送及處理、樣本中細(xì)菌含量過低、核酸過度降解或擴(kuò)增反應(yīng)體系中靶標(biāo)濃度低于檢測限均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。9.5.2 未經(jīng)驗(yàn)證的其他干擾或 PCR 抑制因子等可能會(huì)導(dǎo)致—28——假陰性結(jié)果（如有） 。10.【產(chǎn)品性能指標(biāo)】簡述以下性能指標(biāo)：10.1 對(duì)國家參考品檢測的符合情況，簡要描述采用國家參考品進(jìn)行檢測的結(jié)果（如適用） 。10.2 最低檢測限：簡單介紹最低檢測限的確定方法，并明確最低檢測限結(jié)果。重點(diǎn)考慮原始模板中突變序列的百分率和擴(kuò)增終體系中核酸濃度兩個(gè)因素對(duì)最低檢測限的影響。10.3 陽性/陰性參考品符合率。10.4 精密度：簡單介紹精密度的確定方法，并明確精密度結(jié)果。10.5 分析特異性10.5.1 野生型驗(yàn)證：應(yīng)采用不同濃度的野生型樣本進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果應(yīng)均為陰性。10.5.2 可檢測突變之間的交叉反應(yīng)：如申報(bào)產(chǎn)品可檢測多種突變，還需驗(yàn)證申報(bào)產(chǎn)品聲稱的所有突變類型之間是否存在交叉反應(yīng)。10.5.3 干擾物質(zhì)驗(yàn)證：樣本中常見干擾物質(zhì)對(duì)檢測結(jié)果的影響。10.6 對(duì)比試驗(yàn)研究（如有）：簡要介紹對(duì)比試劑（方法）的信息、所采用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。11.【注意事項(xiàng)】應(yīng)至少包括以下內(nèi)容：11.1 如該產(chǎn)品含有人源或動(dòng)物源性物質(zhì)，應(yīng)給出具有潛在感染性的警告?！?9——11.2 臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》 （衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)〔2010〕194 號(hào)或現(xiàn)行有效版本）等有關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范執(zhí)行。（九）產(chǎn)品技術(shù)要求產(chǎn)品技術(shù)要求應(yīng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊(cè)申報(bào)資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告 2014 年第 44 號(hào)）的相關(guān)規(guī)定。申請(qǐng)人應(yīng)按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的有關(guān)要求，編寫產(chǎn)品技術(shù)要求，內(nèi)容主要包含產(chǎn)品性能指標(biāo)和檢驗(yàn)方法，并以附錄的形式明確主要原材料、生產(chǎn)工藝及半成品檢定要求。該類試 劑 的 注 冊(cè) 檢 驗(yàn) 主 要 包 括 以 下 性 能 指 標(biāo) ： 物 理 性 狀 、陰 /陽 性 參 考 品 符 合 率 、 精 密 度 和 最 低 檢 測 限 等 。 陽 性 參 考 品 主要 考 察 對(duì) 申 報(bào) 產(chǎn) 品 覆 蓋 范 圍 內(nèi) 不 同 突 變 類 型 的 檢 測 符 合 性 ， 陰性 參 考 品 則 重 點(diǎn) 對(duì) 申 報(bào) 產(chǎn) 品 的 分 析 特 異 性 進(jìn) 行 驗(yàn) 證 。如果申報(bào)產(chǎn)品已有相應(yīng)的國家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布，則產(chǎn)品技術(shù)要求不得低于國家/ 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求。（十）注冊(cè)檢驗(yàn)根據(jù)《辦法》的要求，首次申請(qǐng)注冊(cè)的第三類產(chǎn)品應(yīng)該在具有相應(yīng)承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù) 3 個(gè)生產(chǎn)批次樣品的注冊(cè)檢驗(yàn)。對(duì)于已有國家標(biāo)準(zhǔn)品/參考品的檢測項(xiàng)目，在注冊(cè)檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)采用相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)品/參考品進(jìn)行檢驗(yàn)，并符合相關(guān)要求。對(duì)于目前尚無國家標(biāo)準(zhǔn)品/參考品的項(xiàng)目，申請(qǐng)人應(yīng)—30——建立自己的參考品體系并提供相應(yīng)的內(nèi)部參考品。對(duì)于 c 類預(yù)期用途的產(chǎn)品，如果沒有國家參考品，注冊(cè)檢驗(yàn)可采用企業(yè)參考品對(duì)國內(nèi)已報(bào)告的常見突變類型進(jìn)行驗(yàn)證。常見突變類型的確定方法可參考本指導(dǎo)原則的“4.1 陽性參考品” 。三、名詞解釋1.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) polymerase chain reaction, PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種對(duì)特定的 DNA或 RNA 片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法。由變性—退火—延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。2.熒光探針 PCR 在 PCR 過程中利用熒光染料釋放的熒光能量的變化直接反映出 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，并通過對(duì)熒光的采集和分析以達(dá)到對(duì)原始模板量進(jìn)行分析的 PCR。3.分析特異性 analytical specificity測量程序只測量被測量物的能力。分析特異性用于描述檢測程序在樣本中有其他物質(zhì)存在時(shí)只測量被測量物的能力。通常以一個(gè)被評(píng)估的潛在干擾物清單來描述，并給出在特定醫(yī)學(xué)相關(guān)濃度值水平的分析干擾程度。注：潛在干擾物包括干擾物和交叉反應(yīng)物。4.精密度 precision在規(guī)定條件下，相互獨(dú)立的測試結(jié)果之間的一致程度。精密度的程度是用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法得到的測量不精密度的數(shù)字形式表示，如標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV ）。