《重組DNA技術(shù)》PPT課件

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1、重組DNA技術(shù),第 十 章,目 錄,第 一 節(jié)自然界的DNA的重組 DNA Recombination,DNA重組,細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,接合作用、轉(zhuǎn)化作用、轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,轉(zhuǎn)座重組 （自學(xué)）,同源重組,特異位點的重組（自學(xué)）,發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組，又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。,以E.coli的同源重組為例，了解同源重組機(jī)制的Holliday模型。,一、同源重組,Holliday模型中，同源重組主要4個關(guān)鍵步驟,兩個同源染色體DNA排列整齊 一個DNA的一條鏈斷裂、并與另一個DNA對應(yīng)的鏈連接，形成H

2、olliday中間體 通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈重組體DNA，分別為：,Holiday中間體,目 錄,片段重組體 ： 切開的鏈與原來斷裂的是同一條鏈，重組體含有一段異源雙鏈區(qū)，其兩側(cè)來自同一親本DNA。,拼接重組體： 切開的鏈并非原來斷裂的鏈，重組體異源雙鏈區(qū)的兩側(cè)來自不同親本DNA。,片段重組體,拼接重組體,目 錄,二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組,接合作用 轉(zhuǎn)化作用 轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 細(xì)胞融合,（一）接合作用,當(dāng)細(xì)胞或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒DNA從一個細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌），這種DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用。,質(zhì)粒 細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈

3、DNA分子,可接合質(zhì)粒如 F 因子(F factor),（二）轉(zhuǎn)化作用,通過自動獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型，稱為轉(zhuǎn)化作用 。,例：溶菌時，裂解的DNA片段被另一細(xì)菌攝取。,（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,當(dāng)病毒從被感染的細(xì)胞（供體）釋放出來、再次感染另一細(xì)胞（受體）時，發(fā)生在供體細(xì)胞與受體細(xì)胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。,噬菌體的生活史,溶菌生長途徑 溶源菌生長途徑,例,目 錄,目 錄,第 二 節(jié) 基因工程,DNA Recombination Technique,重組DNA技術(shù)的發(fā)展史,年 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗 1944年 O.T.Avery的

4、肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗 1973年 美國斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個重組DNA分子 1977年 美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。 1980年 開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠 1997年 英國羅林研究所成功的克隆了多莉,相關(guān)概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因載體 基本原理 重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系,主要內(nèi)容,一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念,克隆(clone) 來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。,獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。,（一） DNA克隆,技術(shù)水平：分子克隆 即DNA 克隆

5、細(xì)胞克隆 個體克?。▌游锘蛑参铮?DNA克隆 應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子復(fù)制子，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一DNA分子。 也稱基因克隆或重組DNA 。,生物技術(shù)工程: 基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等,目的 分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）,基因工程(genetic engineering) 實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)。,（二）工具酶,

6、限制性核酸內(nèi)切酶 DNA聚合酶 逆轉(zhuǎn)錄酶 T4DNA連接酶 堿性磷酸酶 末端轉(zhuǎn)移酶 Taq DNA聚合酶,重組DNA技術(shù)中常用的工具酶,限制性核酸內(nèi)切酶,定義 限制性核酸內(nèi)切酶(RE)是識別DNA的特異序列, 并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。,+,Bam H,作用 與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制-修飾系統(tǒng)，限制外源DNA， 保護(hù)自身DNA。,分類 、 （基因工程技術(shù)中常用型）,第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫； 第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫； 第四個字母代表株； 用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。,命名,Hin d,Haemophilus influenzae d株

7、 流感嗜血桿菌d株的第三種酶,類酶識別序列特點 回文結(jié)構(gòu)(palindrome),切口 ：平端切口、粘端切口,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,同功異源酶 來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶。,+,Bam H,+,Bst,同尾酶 有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端。,Bam H,Bg l,+,+,（三）目的基因,cDNA 基因組DNA,目的基因 分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）,（四）基因載體,定義 為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或

8、表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。,常用載體 質(zhì)粒DNA 噬菌體DNA 病毒DNA,克隆載體(cloning vector) 為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。 表達(dá)載體(expression vector) 為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達(dá)載體。,載體的選擇標(biāo)準(zhǔn),能自主復(fù)制； 具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定； 有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點； 分子量小，以容納較大的外源DNA。,1. 質(zhì)粒 (plasmid),特點 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息, 會賦

9、予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。,目 錄,噬菌體DNA改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用cDNA克隆） EMBL系列（置換型，適用基因組克隆）,2. 噬菌體(phage),M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列,M13噬菌體pUC系列的物理圖譜,3. 粘性質(zhì)粒(cosmid),酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC) 細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) 動物病毒DNA改造的載體 （如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）,其他,二、重組DNA技術(shù)基本原理,以 質(zhì) 粒 為

10、載 體 的 DNA 克 隆 過 程,目 錄,（一）目的基因的獲取,1. 化學(xué)合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列 。 2.基因組DNA文庫(genomic DNA library) 3. cDNA文庫(cDNA library) 4. 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR) （見第22章）,* 1、化學(xué)合成法獲取目的基因,由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列,組織或細(xì)胞染色體DNA,基因片斷,克隆載體,重組DNA分子,含重組分子的轉(zhuǎn)化菌,限制性內(nèi)切酶,受體菌,基因組DNA文庫 存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合,

11、* 2、從基因組DNA文庫獲取目的基因,目 錄,（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建,若將外源基因連接到復(fù)制子(基因載體)上,外源DNA就可以作為復(fù)制子的一部分在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制. 在基因克隆中基因載體的選擇與構(gòu)建是一項技術(shù)性很強(qiáng)的工作,直接影響到基因克隆的成敗.,（三）外源基因與載體的連接,1. 粘性末端連接 方式：(1)同一限制酶切位點連接 (2)不同限制酶切位點連接 配伍末端連接 非配伍末端連接,Bam H切割反應(yīng),T4 DNA連接酶 15C,同一限制酶切位點連接,目 錄,Bam H,Bg l,+,+,不同限制酶切位點（配伍末端）的連接,配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。,不同限制酶切位

12、點（非配伍末端）的連接,Eco R切割位點,Bg l切割位點,目 錄,2. 平端連接 適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端 粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端,目 錄,3. 同聚物加尾連接 在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。,載體DNA,目的基因,限制酶或機(jī)械剪切,限制酶,目 錄,4. 人工接頭(linker)連接 由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接。,人工接頭及其應(yīng)用,目 錄,受體菌條件 安全宿主菌（從大腸桿菌K-12改造） 限制酶和重組酶缺陷 處于感受態(tài),導(dǎo)入方式 轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)染

13、 感染,（四）重組DNA導(dǎo)入受體菌,（五）重組體的篩選 1. 直接選擇法 (1) 抗藥性標(biāo)記選擇 (2) 標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue) (3) 分子雜交法 原位雜交 Southern印跡 2. 免疫學(xué)方法 如免疫化學(xué)方法及酶免檢測分析等,(插入失活法) 抗藥性標(biāo)記選擇,目 錄,互補(bǔ),目 錄, 互補(bǔ)的檢測,目 錄,原位雜交,目 錄,Southern印跡,目 錄,雞的肌球蛋白的克隆和檢出,目 錄,重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為,小 結(jié),重組DNA技術(shù)操作的主要步驟,目 錄,表達(dá)體系的建立 表達(dá)載體的構(gòu)建 受體細(xì)胞的建立 表達(dá)產(chǎn)物的分離純化,（六）克隆基因的表達(dá),1. 原核表達(dá)體系 （

14、E.coli表達(dá)體系最為常用） 標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志強(qiáng)啟動子 翻譯調(diào)控序列多接頭克隆位點 E.coli表達(dá)體系的不足 不宜表達(dá)真核基因組DNA 不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì) 表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 (inclusion body) 很難表達(dá)大量可溶性蛋白,大鼠胰島素原cDNA 的表達(dá)和分泌,目 錄,優(yōu)點：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA 可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì) 表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累 缺點：操作技術(shù)難、費(fèi)時、不經(jīng)濟(jì),轉(zhuǎn)染 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程,方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染 DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射,2. 真核表達(dá)體系 酵母、昆蟲、乳類動物細(xì)胞,表達(dá)載體pFASTBACI

15、 的物理圖譜,目 錄,目 錄,（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆 根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認(rèn)識疾病的分子機(jī)制。,三、重組技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系,（二）生物制藥,重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品,目 錄,基因診斷(genetic diagnosis)是利用分子生物學(xué)及分子遺傳的技術(shù)和原理，在DNA水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。,（三）基因診斷,基本過程,區(qū)分或鑒定DNA的異常,分離、擴(kuò)增待測的DNA片斷,標(biāo)準(zhǔn) . 能正確擴(kuò)增靶基因； . 能準(zhǔn)確區(qū)分單個堿基的差別； . 本底或噪聲低，不干擾DNA的鑒定; . 便于完全自動化操作，適合大面積、大人群普查。,（四）基因治療,定義 基因治療(

16、gene therapy)是向有功能缺陷的細(xì)胞補(bǔ)充相應(yīng)功能的基因，以糾正或補(bǔ)償其基因的缺陷，從而達(dá)到治療的目的。,方式 體細(xì)胞基因治療 (somatic cell gene therapy) 性細(xì)胞基因治療 (germ line gene therapy),1. 產(chǎn)前診斷 2. 攜帶者測試 3. 癥候前診斷 4. 遺傳病易感性,（五）遺傳疾病的預(yù)防,轉(zhuǎn)基因技術(shù) 采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動物子宮，使之發(fā)育成個體。,轉(zhuǎn)基因被導(dǎo)入的目的基因 轉(zhuǎn)基因動物(transgenic animal) 目的基因的受體動物,轉(zhuǎn)基因技術(shù),轉(zhuǎn)基因生物是指用實驗方法導(dǎo)入的外

17、源基因在染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整和并能遺傳給后代的一類動物。自從1982年P(guān)almiter等首次將大鼠生長激素基因?qū)诵∈笫芫研坌栽酥?，獲得了個體比對照組大一倍的轉(zhuǎn)基因“超級小鼠”以來，這項高新技術(shù)受到各國重視，發(fā)展迅速，取得不少突破，全世界已申請的工程動物專利達(dá)到80多項。,轉(zhuǎn)基因動物是動物整體水平研究目的基因的生物技術(shù)，特點是“分子及其細(xì)胞水平的操作，組織及動物整體水平表達(dá)”,轉(zhuǎn)基因動物構(gòu)建過程,轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建 將轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入受精卵細(xì)胞或者胚胎干細(xì)胞 將轉(zhuǎn)基因受精卵或胚胎干細(xì)胞植入假孕小鼠子宮中 對轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行鑒定,轉(zhuǎn)基因的技術(shù)方法,DNA顯微注射法 克隆法 胚胎干細(xì)胞技術(shù) 逆轉(zhuǎn)錄病

18、毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 精子載體法等 各有優(yōu)點和缺點，常用的是顯微注射和克隆法,轉(zhuǎn)基因動物的鑒定,Southern雜交 確定外源基因的整合以及整合的拷貝數(shù) RT-PCR 確定外源基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄水平 Western雜交 確定外源基因蛋白質(zhì)的表達(dá)情況 實時PCR（熒光定量PCR）,轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用,（1）建立致病基因表達(dá)、調(diào)控的動物模型 （2）動植物新品種的培育 （3）各種基因工程產(chǎn)品的制備 （4）探討生殖細(xì)胞的基因治療方法,囊性纖維變性是一種遺傳病，患者體內(nèi)會產(chǎn)生粘稠的粘液，阻塞肺部、胰腺和消化器官的內(nèi)部通道，大約有一半的患者活不過31歲。英國PPT公司培育了植入人體基因的克隆羊，羊奶中含有能夠治療

19、囊性纖維變性的人體蛋白。 維爾莫特所在的研究所曾向德國一家藥廠出售一頭這樣的轉(zhuǎn)基因羊，獲得50萬英鎊。,核轉(zhuǎn)移技術(shù) 即動物整體克隆技術(shù)，將動物體細(xì)胞核全部導(dǎo)入另一個體的去胞核的受精卵內(nèi)，使之發(fā)育成個體，即克隆(clone)。 這樣的個體所攜帶的性狀僅來自一個父親或母親個體,為無性繁殖. 1996年,克隆羊”多莉”的產(chǎn)生成為當(dāng)年分子生物學(xué)發(fā)展最重要的事件,核轉(zhuǎn)移技術(shù),克隆羊“多利”,基因剔除技術(shù) 也稱基因靶向(gene targeting)滅活，有目的去除動物體內(nèi)某種基因的技術(shù)。,基因剔除技術(shù),基因剔除程序,將滅活的基因放入胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞),使這一滅活的基因通過同源重組取代原有目的基因,篩選到基因定點滅活的細(xì)胞后,通過顯微注射到小鼠囊胚. 細(xì)胞在小鼠囊胚參與胚胎的發(fā)育,最終形成嵌合體小鼠,由于一部分生殖細(xì)胞來源于ES細(xì)胞,通過小鼠培養(yǎng)可獲得純合子基因剔除小鼠.,基因轉(zhuǎn)移和基因剔除技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,建立動物疾病可遺傳的模型,探討疾病發(fā)生機(jī)制 單基因決定疾病模型 進(jìn)行基因剔除以模擬基因失活. 單基因疾病模型:地中海貧血,動脈硬化,老年癡呆等 多基因決定疾病模型 多基因疾病模型:腫瘤,高血壓,糖尿病,