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1、實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用 (Real time Quantitative PCR) 原理其定量的基本原理是在 PCR 反應(yīng)體系中加入非特異性的熒光染料（如： SYBR GREEN I ）或特異性的熒光探針（如： Taqman 探針），實時檢測熒光量的變化，獲得不同樣品達(dá)到一定的熒光信號（閾值）時所需的循環(huán)次數(shù)： CT 值（ Cycle Threshold ）；通過將已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品的 CT 值與其濃度的對數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以準(zhǔn)確定量樣品的濃度。熒光定量 PCR 技術(shù)具有簡便、快捷的優(yōu)點，能夠有效擴(kuò)增低拷貝的靶片段 DNA ，對每克樣品中 2 0 pg-1 0 ng 的轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行有
2、效檢測。 引物設(shè)計原則： 1 .上下游引物要保守為了能夠擴(kuò)增出所需要的保守片段，必須對保守的1 0 0 -2 0 0片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所以引物的選取也要非常的保守。2 .上下游引物的長度一般為1 8 -3 0 bp之間，且Tm值在5 8 -6 2 之間，上下游引物的Tm值相差最好不超過2 。3 .確保引物中GC含量在3 0 -8 0 %。應(yīng)避免引物中多個重復(fù)的堿基出現(xiàn)，尤其是要避免4個或超過4個的G堿基出現(xiàn)。引物的3 端最好不為G或/和C。引物3 端的5個堿基不應(yīng)出現(xiàn)2個G或/和C。4 .避免引物內(nèi)出現(xiàn)反向重復(fù)序列形成發(fā)夾二級結(jié)構(gòu)，同時也應(yīng)避免引物間配對形成引物二聚體。5跨外顯子設(shè)計引物，用
3、于區(qū)別或消除DNA的擴(kuò)增。 什么是探針：生物方面探針是一小段單鏈DNA或者RNA片段（大約是2 0到5 0 0 bp）， 用于檢測與其互補(bǔ)的核酸序列。雙鏈DNA加熱變性成為單鏈，隨后用放射性同位素（通常用磷-3 2）、螢光染料或者酶（如辣根過氧化物酶）標(biāo)記成為探針。磷-3 2通常被摻入組成DNA的四種核苷酸之一的磷酸基團(tuán)中，而熒光染料和酶與核酸序列以共價鍵相連。 當(dāng)將探針與樣品雜交時，探針和與其互補(bǔ)的核酸（DNA或RNA）序列通過氫鍵緊密相連，隨后，未被雜交的多余探針被洗去。最后，根據(jù)探針的種類，可進(jìn)行放射自顯影、螢光顯微鏡、酶聯(lián)放大等方法來判斷樣品中是否，或者何位置含有被測序列（即與探針互補(bǔ)
4、的序列）。 探針設(shè)計原則 1 . 保守：探針要絕對的保守，有時分型就僅僅依靠探針來決定。理論上有一個堿基不配對，就可能檢測不出來。2 . Taqman探針的長度最好在2 5 -3 2 bp之間，且Tm值在6 8 -7 2 之間，確保探針的Tm值要比引物的Tm值高出5 -1 0 ，這樣可保證探針在退火時先于引物與目的片段結(jié)合。3 . 確保探針中GC含量在3 0 -8 0 %。4 . 避免探針中多個重復(fù)的堿基出現(xiàn)，尤其是要避免4個或超過4個的G堿基5 . 探針的5 端不能為G，因為即使單個G堿基與FAM熒光報告基團(tuán)相連時， 也可以淬滅FAM基團(tuán)所發(fā)出的熒光信號，從而導(dǎo)致假陰性的出現(xiàn)。6 . Taq
5、man探針應(yīng)靠近上游引物，即Taqman探針應(yīng)靠近與其在同一條鏈上的 上游引物。兩者的距離最好是探針的5 端離上游引物的3 有一個堿基。7 . 避免探針與引物之間形成二級結(jié)構(gòu)。8 . 對于多重定量PCR，例如SNP分型檢測時，SNP位點應(yīng)設(shè)計在探針的中間位置，并且兩種探針的Tm值應(yīng)相近。 2、TaqMan探針法 TaqMan作用機(jī)理 TaqMan法優(yōu)缺點 基因表達(dá)絕對定量、相對定量基因表達(dá)的相對絕對定量絕對定量是用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來推算未知樣本的量，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至不同濃度，作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以測得的 C t值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對未知樣品進(jìn)行定量時，根據(jù)未知樣品的c 值，即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到樣品的拷貝數(shù)。質(zhì)粒 DNA和體外轉(zhuǎn)錄的RNA常作為絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)品。相對定量指的是在一定樣本中靶基因相對于另一參照基因的量的變化。
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