分子克隆技術(shù)實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)

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1、 分 子 克 隆 技 術(shù) 實(shí) 驗(yàn) 操 作 手 冊(cè) 李香花 吳昌銀 邢永忠 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 1 課程簡(jiǎn)介 分子克隆技術(shù)是指 DNA 的無性繁殖技術(shù)。分子克隆技術(shù)課程主要是 針對(duì)生物技術(shù)專業(yè)、生物科學(xué)專業(yè)、生命科學(xué)與技術(shù)基地班本科生及生 物學(xué)類專業(yè)研究生而開設(shè)的實(shí)驗(yàn)課。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容涉及分子克隆的一些基本 方法及基本操作技巧，主要包括分子克隆、分子雜交和表達(dá)檢測(cè)三部分 分子克隆技術(shù)：DNA 重組技術(shù)是分子生物學(xué)的核心內(nèi)容。本實(shí)驗(yàn)利 用質(zhì)粒載體克隆外源 DNA 片段，通過這個(gè)實(shí)驗(yàn)大家可以掌握質(zhì)粒載體的 抽提、外源 DNA 的準(zhǔn)備、酶切、連接及感受態(tài)細(xì)胞的制備、連接產(chǎn)物的 轉(zhuǎn)化以及陽性克隆子的

2、鑒定和驗(yàn)證等。 分子雜交技術(shù)：實(shí)驗(yàn)室常用的分子雜交技術(shù)主要有 Southern blotting，Northern blotting，Western blotting 及 Dot blotting 等。Southern blotting 是通過用一種或多種限制性內(nèi)切酶消化基因組 或其它來源的 DNA，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳按大小分離酶切所得的片段， 隨后 DNA 在原位發(fā)生變性并從凝膠轉(zhuǎn)移到一固相支持物上（硝酸纖維素 膜或尼龍膜） 。DNA 轉(zhuǎn)移至固相支持物的過程中各 DNA 的相對(duì)位置保持 不變，用一定方法(如放射性同位素或 DIG)標(biāo)記的 DNA 探針與固著在膜 上的 DNA 雜交，經(jīng) X-光

3、片自顯影或顯色顯現(xiàn)出與探針 DNA 互補(bǔ)的 DNA 電泳條帶的位置，然后進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)要求掌握植物總 DNA 的抽提、 質(zhì)量檢測(cè)、限制性內(nèi)切酶操作、DNA 的瓊脂糖凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、探針的 制備、同位素操作等方面的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 2 表達(dá)檢測(cè)：在轉(zhuǎn)錄水平上研究和了解基因的表達(dá)與調(diào)控是分子生物 學(xué)和基因操作的重要內(nèi)容。本實(shí)驗(yàn)通過 RT-PCR 技術(shù)訓(xùn)練學(xué)生掌握 RNA 的抽提、反轉(zhuǎn)錄及 PCR 技術(shù)等。 分子克隆技術(shù)實(shí)驗(yàn)課是從事生命科學(xué)相關(guān)研究的學(xué)生從課堂走進(jìn) 實(shí)驗(yàn)室，順利開展科研工作的必經(jīng)之路。希望學(xué)生通過以上三個(gè)實(shí)驗(yàn)的 綜合訓(xùn)練能夠?yàn)樘岣邔?shí)際動(dòng)手能力和實(shí)驗(yàn)自主設(shè)計(jì)能力打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。 3 目 錄

4、系列一 分子克隆技術(shù) .5 實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒的制備 .5 實(shí)驗(yàn)二 DNA 的瓊脂糖凝膠電泳 .6 實(shí)驗(yàn)三 外源 DNA 片段在質(zhì)粒載體中的克隆 .8 實(shí)驗(yàn)四 感受態(tài)細(xì)胞的制備 .10 CaCl2 感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)步驟 .10 電轉(zhuǎn)化法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)步驟 .11 實(shí)驗(yàn)五 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的鑒定 .12 熱激法轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟： .12 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞操作步驟 .13 系列二 Southern 技術(shù) .14 實(shí)驗(yàn)一 植物總 DNA 的快速少量抽提（CTAB 法） .14 實(shí)驗(yàn)二 總 DNA 質(zhì)量檢測(cè)及酶切 .15 實(shí)驗(yàn)三 電泳、轉(zhuǎn)膜 .16 實(shí)驗(yàn)四 Southern 雜交

5、 .18 系列三 表達(dá)檢測(cè) .24 實(shí)驗(yàn)一 RNA Extraction (mini prep) .24 實(shí)驗(yàn)二 RT-PCR (Reverse transcription PCR).26 實(shí)驗(yàn)三 RNA 的電泳，轉(zhuǎn)膜和雜交 .28 附錄 試劑配方 .29 4 一 細(xì)菌培養(yǎng)試劑 .30 二 質(zhì)粒抽提試劑 .31 三 DNA 操作試劑 .31 四 RNA 操作試劑 .35 Stock Solution:.35 Work Solution .35 系列一 分子克隆技術(shù) .4 實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒的制備 .4 實(shí)驗(yàn)二 DNA 的瓊脂糖凝膠電泳 .5 實(shí)驗(yàn)三 外源 DNA 片段在質(zhì)粒載體中的克隆 .7 實(shí)驗(yàn)四

6、 感受態(tài)細(xì)胞的制備 .9 CaCl2 感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)步驟 .10 電轉(zhuǎn)化法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)步驟 .10 實(shí)驗(yàn)五 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的鑒定 .11 熱激法轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟： .12 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞操作步驟 .12 系列二 South ern 技術(shù) .14 一、植物總 DNA 的快速少量抽提（CTAB 法） .17 二、總 DNA 質(zhì)量檢測(cè)及酶切 .18 三、 .18 電泳、轉(zhuǎn)膜 .18 探針標(biāo)記及雜交 .20 方法一 放射性 .20 同位素標(biāo)記探針的 Southern 雜交 .20 方法二 地高辛標(biāo)記探針的 Southern 雜交實(shí)驗(yàn)步驟： .22 系列三 表達(dá)檢測(cè)

7、.26 實(shí)驗(yàn)一 RNA Extraction (mini prep).26 實(shí)驗(yàn)二 RT-PCR (Reverse transcription PCR) .28 實(shí)驗(yàn)三 RNA 的電泳，轉(zhuǎn)膜和雜交 .31 附錄 試劑配方 .33 一 細(xì)菌培養(yǎng)試劑 .33 二 質(zhì)粒抽提試劑 .34 三 DNA 操作試劑 .34 四 RNA 操作試劑 .39 Stock Solution: .39 Work Solution .40 5 6 系列一 分子克隆技術(shù) 實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒的制備 質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。 質(zhì)粒的分離與提取是最常用、最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 質(zhì)粒的

8、提取方法很多，大多包括 3 個(gè)主要步驟：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和 裂解、質(zhì)粒 DNA 的分離和純化。本實(shí)驗(yàn)以堿裂解法為例，介紹質(zhì)粒的抽提過程。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆諌A裂解法抽提質(zhì)粒的原理、步驟及各試劑的作用。 實(shí)驗(yàn)材料：含有質(zhì)粒 pUC18（或 pUC19）載體的大腸桿菌菌液，克隆有水稻外源 片段的 BAC 的大腸桿菌菌液。 實(shí)驗(yàn)原理：在 pH 12.0 12.6 堿性環(huán)境中，細(xì)菌大分子量染色體 DNA 變性分開， 而共價(jià)閉環(huán)的質(zhì)粒 DNA 雖然變性但仍處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)。將 pH 調(diào)至 中性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色體 DNA、大分子量的 RNA 和蛋白質(zhì)在去污劑 SDS 的作用下形成沉

9、淀，而質(zhì)粒 DNA 仍然為 可溶狀態(tài)。通過離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體 DNA、RNA 及 蛋白質(zhì)，質(zhì)粒 DNA 尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒 DNA。 實(shí)驗(yàn)步驟： 取含有 pUC18（或 pUC19）質(zhì)粒或含有 BAC 的大腸桿菌菌液分別于含氨芐青霉素 或氯霉素的 LA 培養(yǎng)基上劃線分離單菌落，37培養(yǎng)過夜； 用接種環(huán)或無菌牙簽挑取單菌落，接種于含有相應(yīng)抗生素的 LB 培養(yǎng)基中，置于轉(zhuǎn) 速250 r/min 的搖床上， 37C 培養(yǎng)過夜； 吸取 1.5 ml 菌液， 12000 rpm 離心 2 分鐘，收集菌體，倒掉菌液，再吸取 1.5 ml 菌 液于同一離心管內(nèi)，再次

10、離心收集菌體，將菌液盡量倒干凈； 加入 300 l 溶液 I，重新懸浮細(xì)胞，振蕩器上混勻（注意：應(yīng)徹底打勻菌體沉淀） ； 加入 300 l 溶液 II，輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過 5 分鐘； 7 加入 300 l 溶液 III，顛倒混勻，放置于冰上 10 分鐘，使雜質(zhì)充分沉淀； 12000 rpm 離心 10 分鐘； 吸取 800 l 上清液（注意：不要吸取到飄浮的雜質(zhì)）轉(zhuǎn)至另一 1.5ml 離心管中，加 入 2/3 體積的異丙醇，室溫下放置 5 分鐘； 12000 grpm 常溫離心 10 分鐘； 倒盡上清，加 75乙醇浸洗除鹽（放置片刻或離心 3 分鐘后倒去上清） ； 室溫放置或

11、超凈臺(tái)上風(fēng)干 DNA； 加 40 l 滅菌超純水或 TE 溶解； 質(zhì)粒、BAC 的質(zhì)量檢測(cè)，于-20保存。 附注：質(zhì)粒檢測(cè) 電泳檢測(cè)：質(zhì)粒電泳一般有三條帶，分別為質(zhì)粒的超螺旋、開環(huán)、線型三種 構(gòu)型 吸光值檢測(cè)：采用分光光度計(jì)檢測(cè) 260nm、280nm 波長(zhǎng)吸光值，若吸光值 260nm/280nm 的比值介于 1.81.9 之間，說明質(zhì)粒質(zhì)量較好，1.8 為最佳，低了說 明有蛋白質(zhì)污染，高了說明有 RNA 污染。 實(shí)驗(yàn)二 DNA 的瓊脂糖凝膠電泳 帶電荷的物質(zhì)在電場(chǎng)中的趨向運(yùn)動(dòng)稱為電泳。電泳的種類多，應(yīng)用非常廣泛， 它已成為分子生物學(xué)技術(shù)中分離生物大分子的重要手段。瓊脂糖凝膠電泳由于其操 作簡(jiǎn)

12、單、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，已成為分離和鑒定核酸的常用方法。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆窄傊悄z電泳的原理，學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的操作。 實(shí)驗(yàn)材料：質(zhì)粒 DNA、BAC、植物總 DNA 或它們的酶切產(chǎn)物。 實(shí)驗(yàn)原理：在 pH 值為 8.08.3 時(shí)，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核 酸分子帶負(fù)電，在電泳時(shí)向正極移動(dòng)。采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為 電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子 8 泳動(dòng)率出現(xiàn)較大的差異，從而達(dá)到分離核酸片段檢測(cè)其大小的目的。 核酸分子中嵌入熒光染料（如 EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段 所在的位置。 實(shí)驗(yàn)步驟： 用膠帶將洗凈、干燥的制膠板的兩端封好，水平放

13、置在工作臺(tái)上； 調(diào)整好梳子的高度； 稱取 0.24 g 瓊脂糖于 30 ml 0.5TBE 中，在微波爐中使瓊脂糖顆粒完全溶解，冷卻 至 45-50C 時(shí)倒入制膠板中； 凝膠凝固后，小心拔去梳子，撕下膠帶； 將電泳樣品與溴酚藍(lán)混合后將樣品依次點(diǎn)入加樣孔中； pUC18： 5l DNA + 3l ddH2O + 2l 溴酚藍(lán)共 10l 于 0.5ml tube 中混合后點(diǎn)樣； BAC：10l2l 溴酚藍(lán)于 0.5ml tube 中混合后點(diǎn)樣 注意：記錄不同樣品的泳道位置 將制膠板放入電泳槽中，加入 0.5TBE 電泳緩沖液至剛剛淹沒凝膠，打開電泳儀， 使核酸樣品由負(fù)極向正極泳動(dòng)； 電泳完成后切斷

14、電源，取出凝膠，放入 0.5 g/ml 的溴化乙錠（EB）溶液中染色 1015 min，清水漂洗后置于紫外透射儀上觀察電泳結(jié)果，并照相記錄。 附注： 1影響 DNA 在瓊脂糖凝膠中遷移速率的因素： DNA 分子大小 遷移速率 U 與 logN 成反比（N 為堿基對(duì)數(shù)目） 。分子大小相等， 電荷基本相等（DNA 結(jié)構(gòu)重復(fù)性） 。分子越大，遷移越慢。等量的空間結(jié)構(gòu)緊 密的電泳快（超螺旋線性 DNA） 瓊脂糖濃度：logU=logU 0 Kr 膠濃度，U 為遷移率，U 0 為 DNA 的自由電泳遷移 率， 為膠濃度，Kr 為介質(zhì)阻滯系數(shù)。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的 DNA Agarose： 0.

15、5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb 1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb. DNA 構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀線狀 DNA，當(dāng)條件變化時(shí)，情況會(huì)相反， 還與瓊脂糖的濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及 EB 含量有關(guān)。 9 所加電壓：低電壓時(shí)，線狀 DNA 片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效 果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過 5V/cm 堿基組成與溫度：一般影響不大 4 -30 嵌入染料的存在：降低線性 DNA 遷移率，(不提倡加在電泳液中 ) 電泳緩沖液 （0.5TBE）的組成及其離子強(qiáng)度影響 DNA 的遷移率，無離子存在 時(shí)，核酸基本不泳動(dòng)，離子強(qiáng)度

16、過大產(chǎn)熱厲害，熔化凝膠并導(dǎo)致 DNA 變性， 一般采用 1TAE，1TBE ，1TPE（均含 EDTA pH8.0） 。 2溴化乙錠（EB）為致癌劑，操作時(shí)應(yīng)戴手套，盡量減少臺(tái)面污染。 3電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)（bromophenol blue, Bb） 呈藍(lán)紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少， 在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢。 實(shí)驗(yàn)三 外源 DNA 片段在質(zhì)粒載體中的克隆 DNA 重組技術(shù)包括載體及外源 DNA 片段的酶切消化、目的片段的獲得及純 化、目的片段與克隆載體的體外連接、重組子的篩選和鑒定等內(nèi)容。DNA 片段的

17、 克隆技術(shù)是分子操作的核心部分。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí) DNA 的酶切、純化及外源片段與載體的連接，將 BAC 克隆所攜 帶的外源 DNA 酶切片段亞克隆到 pUC18 載體上。 實(shí)驗(yàn)材料：外源片段來自一個(gè)含有水稻 DNA 片段的 BAC 克隆的酶切片段；克隆 載體為 pUC18。 實(shí)驗(yàn)原理：限制性內(nèi)切酶可識(shí)別特定位點(diǎn)并切割 DNA 產(chǎn)生粘性末端或平末端的外 源片段，經(jīng)純化處理后的 DNA 用于連接反應(yīng)；選擇克隆載體 pUC18 多克隆位點(diǎn)上相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割，并用堿性磷酸酶處理防止載 體自連；在連接酶的作用下將外源片段連接到載體上，實(shí)現(xiàn)外源片段 的克隆。 實(shí)驗(yàn)步驟： 載體 pUC18 和外源

18、DNA 片段的限制性酶切： 10 （50 l 反應(yīng)體系，用 1.5ml tube，冰上操作）： DNA 30 l R.E（10U/ l） 1 l 10buffer 5 l ddH2O 14 l 37反應(yīng) 1- 12 小時(shí)，分別取 8 l 外源片段酶切產(chǎn)物和 5 l pUC18 酶切產(chǎn)物 于 1.0%凝膠檢測(cè)酶切是否完全；按 25 步純化、回收 DNA 加入 150 l ddH2O（擴(kuò)大體積） ，加入 200l 氯仿/異戊醇（24:1 ） ，顛倒混勻， 12000rpm 離心 10 min； 吸取上清，加 1/10 體積 3M NaAc 和兩倍體積無水乙醇，-20放置 15 分鐘以上； 1200

19、0rpm 4冷凍離心 15 分鐘； 倒去上清，用 75乙醇浸洗沉淀，風(fēng)干后外源 DNA 溶于 10 l ddH2O，pUC18 溶 于 20 l ddH2O； 按以下反應(yīng)去除載體 pUC18 的 5磷酸基團(tuán)： 酶切后的 pUC18 DNA 20 l CIAP（TaKaRa） 0.5 l 10 buffer 4.0 l ddH2O 15.5 l 50反應(yīng) 30 min 以上 70水浴 10 min, 使 CIAP 失活； 按 25 步純化載體，溶于 10 l ddH2O； 連接反應(yīng)（10 l 體系）： 外源 DNA 5 l pUC18 載體 2.5 l 5 buffer 1.5 l T4 lig

20、ase (3U/l) 1 l 16水浴過夜 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 轉(zhuǎn)化子的鑒定 11 附注： 根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮屯庠雌蔚牟煌蛇x用不同的載體，采用不同粘性末端的雙酶切可 實(shí)現(xiàn)外源片段的定向克隆。 克隆中用到的幾種工具酶： （1）限制性內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切酶的一個(gè)活性單位（1U）：指在 50 l 反應(yīng)體系中，37下，經(jīng)過 1 小時(shí)的反應(yīng)將 1g DNA 完全切割所需要的酶量。 限制性內(nèi)切酶的 star 活性：限制酶在某些條件下使用時(shí)對(duì) DNA 切割的位點(diǎn)特 異性可能降低，即可以切割與原來識(shí)別的特定 DNA 序列不同的堿基序列，這種現(xiàn) 象叫限制酶的 star 活性。它的出現(xiàn)與限制酶、底物 DNA 以

21、及反應(yīng)條件有關(guān)。 （2）堿性磷酸酶 細(xì)菌堿性磷酸酶（BAP）和牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）都能催化水解 DNA、 RNA、dNTP 和 NTP 上的 5磷酸殘基。比較而言， CIAP 更常用，因其可 在 70 10內(nèi)加熱滅活或通過苯酚抽提而變性失活，同時(shí) CIAP 的活性比 BAP 的 高 1020 倍。它主要用于：（1）克隆時(shí)去除載體的 5-P，以防載體自連；（2） 在用 Kinase 進(jìn)行 5末端標(biāo)記前，去除 DNA 的 5-P。 （3）連接酶 體外催化磷酸二酯鍵的形成可使用兩種酶：大腸桿菌連接酶和 T4 噬菌體連接 酶，但幾乎在所有的克隆中 T4 噬菌體連接酶都是首選的酶，因其能在正常的

22、反應(yīng) 條件下能有效的將平端連接起來。 氯仿對(duì)眼睛、皮膚、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌劑并可損傷肝臟和腎臟， 操作時(shí)需戴手套、安全鏡并在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。苯酚是強(qiáng)腐蝕劑，能引起嚴(yán)重?zé)?傷。操作時(shí)應(yīng)戴手套、安全鏡、穿防護(hù)服，并在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。 實(shí)驗(yàn)四 感受態(tài)細(xì)胞的制備 體外連接的 DNA 重組分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞才能大量增殖。為了提高受體菌 攝取外源 DNA 的能力，提高轉(zhuǎn)化效率以獲得更多的轉(zhuǎn)化子，人們摸索出了不同的方 法處理細(xì)菌，使其處于感受態(tài)。目前主要采用電轉(zhuǎn)化法和 CaCl2法將外源 DNA 導(dǎo)入 受體細(xì)胞中，并需要相應(yīng)地制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞和 CaCl2感受態(tài)細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)感受

23、態(tài)細(xì)胞的制備過程 12 實(shí)驗(yàn)材料：大腸桿菌菌株 DH5或 DH10B 實(shí)驗(yàn)原理：電轉(zhuǎn)化法是利用瞬間高壓在細(xì)胞上打孔，因而需用冰冷的超純水多次洗 滌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期的細(xì)胞，以使細(xì)胞懸浮液中應(yīng)含有盡量少的導(dǎo)電離子。轉(zhuǎn)化效 率為 10910 10 轉(zhuǎn)化子/g DNA；對(duì)于熱激法，是利用冰冷的 CaCl2 處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 期的細(xì)胞，可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生短暫的“感受態(tài)” ，易于攝取外源 DNA。轉(zhuǎn)化效率為 106 10 7 轉(zhuǎn)化子/g DNA。 CaCl2感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)步驟 前夜接種受體菌（DH5或 DH10B） ，挑取單菌落于 LB 培養(yǎng)基中 37搖床培養(yǎng)過夜 （約 16 小時(shí)） ； 取 1ml 過夜培

24、養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于 100ml LB 培養(yǎng)基中，在 37搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約 2.5- 3 小時(shí)（250-300rpm） ； 將 0.1M CaCl2溶液置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工作臺(tái)和冰上操作 吸取 1.5ml 培養(yǎng)好的菌液至 1.5ml 離心管中，在冰上冷卻 10 分鐘； 4下 3000 g 冷凍離心 5 分鐘； 棄去上清，加入 100l 預(yù)冷 0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì) 胞重新懸浮，在冰放置 20 分鐘； 4下 3000 g 冷凍離心 5 分鐘； 棄去上清，加入 100l 預(yù)冷 0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì) 胞重新懸??； 細(xì)胞懸浮液

25、可立即用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)或添加冷凍保護(hù)劑（15% - 20%甘油）后超低溫冷 凍貯存?zhèn)溆茫?0） 。 電轉(zhuǎn)化法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)步驟 前夜接種受體菌（DH5或 DH10B） ，挑取單菌落于 LB 培養(yǎng)基中 37搖床培養(yǎng)過夜； 取 2ml 過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于 200ml LB 培養(yǎng)基中，在 37搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)至 OD6000.6（約 2.5-3 小時(shí)） ； 將菌液迅速置于冰上。以下步驟務(wù)必在超凈工作臺(tái)和冰上操作 吸取 1.5ml 培養(yǎng)好的菌液至 1.5ml 離心管中，在冰上冷卻 10 分鐘； 4下 3000g 冷凍離心 5 分鐘，收集菌體，棄去上清。必要時(shí)可收集 2 次； 加入 1500l

26、 冰冷的 10%甘油，使細(xì)胞重新懸浮（先加 750l 用移液槍輕輕上下吸 動(dòng)打勻，再加 750l 混勻） ； 13 4下 3000g 冷凍離心 5 分鐘； 棄去上清，加入 750l 冰冷的 10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新 懸??； 4下 3000g 冷凍離心 5 分鐘； 加入 20l 冰冷 10%的甘油，用移液器輕輕上下吸動(dòng)打勻，使細(xì)胞重新懸浮； 立即使用或迅速置于-70C 超低溫保存。 附注： 影響感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的因素及實(shí)際操作過程中應(yīng)注意的事項(xiàng)： 細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)：實(shí)驗(yàn)中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度，盡量使用對(duì)數(shù)生 長(zhǎng)期的細(xì)胞（一般通過檢測(cè) OD600 來控制。DH5菌

27、株 OD600 為 0.5 時(shí)細(xì)胞 密度是 5107/ml） ； 所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行； 經(jīng) CaCl2 處理的細(xì)胞，在低溫條件下，一定的時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的推移而增 加，24 小時(shí)達(dá)到最高，之后轉(zhuǎn)化率再下降（這是由于總的活菌數(shù)隨時(shí)間延 長(zhǎng)而減少造成的） ； 化合物及無機(jī)離子的影響：在 Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價(jià)金屬離子（如 Mn2+或 Co2+） 、DMSO 或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高（ 100- 1000 倍） ； 所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì) 菌的轉(zhuǎn)化效率； 質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響：用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的 DNA

28、； 一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與外源 DNA 的濃度呈正比； 實(shí)驗(yàn)五 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的鑒定 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)粒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感 受態(tài)細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)重組克隆的增殖，便于后續(xù)分子操作?？梢圆捎枚喾N方法篩選和鑒定目的克 隆。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆諢峒しɑ螂娹D(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化子的鑒定方法。 14 實(shí)驗(yàn)材料：外源片段與載體的連接產(chǎn)物；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)原理：（1）熱激法：大腸桿菌在 0 CaCl2 低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合 物中的 DNA 形成抗 DNase 的羥基鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng) 42短時(shí) 間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收

29、 DNA 復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球 狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖。在被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，重組子基因得到表達(dá)，在選擇性培 養(yǎng)基平板上可挑選所需的轉(zhuǎn)化子。 （2）電轉(zhuǎn)化法：外加于細(xì)胞膜上的電場(chǎng)造成細(xì)胞膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔，不僅 有利于離子和水進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，也有利于孔 DNA 等大分子進(jìn)入。同時(shí) DNA 在電場(chǎng) 中形成的極性對(duì)于它運(yùn)輸進(jìn)細(xì)胞也是非常重要的。 熱激法轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟： 制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化的 250ml LA 培養(yǎng)基中 250 l Amp（100mg/ml） ， 250 l X-gal (20mg/ml)，25 l IPTG (200mg/ml)，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中； 取出

30、 3 管制備好的感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化； 每 100 l 感受態(tài)細(xì)胞加入約 20ng 質(zhì)粒 DNA，3 管分別加連接產(chǎn)物、標(biāo)準(zhǔn)超螺旋質(zhì) 粒 DNA（陽性對(duì)照）及不加入任何 DNA（陰性對(duì)照） ，用移液器輕輕吸打均勻， 在冰上放置 30 分鐘； 熱擊：將離心管放置 42水浴，熱擊 90 秒，注意：勿搖動(dòng)離心管； 冰鎮(zhèn)：快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，放置 12 分鐘； 復(fù)蘇：每管加 400 l SOC 培養(yǎng)基，在 37搖床溫和搖動(dòng)溫育 45 分鐘，使細(xì)菌復(fù)蘇； 布皿：取適當(dāng)體積均勻涂布于含有 IPTG、X-gal、抗生素（Amp）的 LA 平板； 培養(yǎng)：倒置培養(yǎng)皿，于 37培養(yǎng) 1216 小時(shí) 即可觀

31、察到藍(lán)白相間的菌落（其中白 色菌落為含有外源插入片段的轉(zhuǎn)化子，藍(lán)色菌落是載體自連的轉(zhuǎn)化子） 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞操作步驟 1制備選擇性培養(yǎng)基平板：將融化的 250ml LA 培養(yǎng)基冷卻至 50C 左右，加入 250 l Amp（100mg/ml） ，250 l X-gal (20mg/ml)，25 l IPTG (200mg/ml)，混 勻后快速倒入滅菌培養(yǎng)皿中（注意：溫度太高，抗生素失活，溫度太低，培養(yǎng) 基易凝固） ； 2取出制備好的感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化； 15 3每管感受態(tài)細(xì)胞加入 1l 連接產(chǎn)物，用移液器輕輕吸打均勻，置冰上； 4電轉(zhuǎn)化儀選擇 1800V 作為輸出電壓； 5將

32、要轉(zhuǎn)化的混合物加入預(yù)冷的 1 mm 的電轉(zhuǎn)化杯中，立即按下按紐電擊； 6立即加 1ml SOC 培養(yǎng)基到轉(zhuǎn)化杯中重懸細(xì)胞； 7將細(xì)胞轉(zhuǎn)入合適的培養(yǎng)管中 37C 培養(yǎng) 1 小時(shí)； 8吸取合適體積的菌液涂布已倒好的選擇培養(yǎng)基平板； 937C 培養(yǎng)過夜，觀察結(jié)果。 附注： 利用氨芐青霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子時(shí)，用轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪平板的密度要低（90mm 平板上 不得超過 105 個(gè)菌落） ，同時(shí) 37培養(yǎng)不應(yīng)超過 20 小時(shí)，具氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn) 化體可將內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基中，迅速滅活菌落周圍的抗生素，從而導(dǎo)致對(duì) 氨芐青霉素敏感的衛(wèi)星菌落的出現(xiàn)。 鑒定轉(zhuǎn)化子中是否含有外源 DNA 片段常用的方法有： 互補(bǔ)；

33、雜交篩選； 插入失活（一些老質(zhì)粒如 pBR322 等）; 小量提取質(zhì)粒酶切檢測(cè)、PCR 檢測(cè) 16 系列二 Southern 技術(shù) （轉(zhuǎn)基因植物的陽性鑒定及插入的外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)） 主要通過檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中插入的外源基因拷貝數(shù)做 Southern 雜交訓(xùn) 練分子 Southern 雜交的相關(guān)技術(shù)。Southern 雜交是即通過用選擇合適的限制性內(nèi) 切酶消化基因組或其它來源的 DNA，經(jīng)過利用瓊脂糖凝膠電泳按大小分離酶切所得 的片段，隨后 DNA 在原位發(fā)生變性并從凝膠轉(zhuǎn)移到一固相支持物上（一般是硝酸纖 維素膜或如尼龍膜）上。DNA 轉(zhuǎn)移至固相支持物的過程中各 DNA 的相對(duì)位置保持不 變，用

34、一定方法（如放射性同位素、地高辛等）標(biāo)記的 DNA 探針與固著在膜上的 DNA 雜交，經(jīng) X-光片自顯影或顯色反應(yīng)顯現(xiàn)出與探針 DNA 互補(bǔ)的 DNA 電泳條帶的 位置及數(shù)量。 試驗(yàn)?zāi)康模?了解掌握檢測(cè) DNA 質(zhì)量的方法以及 DNA 定量的方法；了解影響 DNA 在瓊脂糖凝 膠中 泳動(dòng)速率的因素；訓(xùn)練 DNA 的瓊脂糖凝膠電泳操作及 DNA 的限制性內(nèi)切酶操 作。 試驗(yàn)原理： 1. DNA 抽提： CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）是一種非離子去污劑，植物材料 在 CTAB 的處理下，結(jié)合 65C 水浴使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)變性、DNA 被釋放出來。 CTAB 與核酸形成復(fù)合物，此復(fù)合物在高鹽（0

35、.7mM）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在， 但在低鹽濃度（0.1-0.5mM NaCl）下 CTAB-核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀，而 大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。經(jīng)離心棄上清后，CTAB-核酸復(fù)合物再 用 7075% 酒精浸泡可洗脫掉 CTAB。再經(jīng)過氯仿/異戊醇(24:1) 抽提去除蛋白質(zhì)、 多糖、色素等來純化 DNA，最后經(jīng)異丙醇或乙醇等 DNA 沉淀劑將 DNA 沉淀分離 出來。 CTAB 法簡(jiǎn)便、快速，DNA 產(chǎn)量高(純度稍次，適用于一般分子生物學(xué)操作)。 2. 總 DNA 質(zhì)量檢測(cè)： 17 在 pH 值為 8.0 - 8.3 時(shí)，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離， 核酸分子

36、帶負(fù)電，在電泳時(shí)向正極移動(dòng)。采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為 電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)象不同的核酸分子泳 動(dòng)率出現(xiàn)較大的差異，從而達(dá)到分離核酸片段檢測(cè)其大小的目的。核酸 分子中嵌入熒光染料（如 EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在 的位置。雖然普通瓊脂糖凝膠無法分辨大于 50kb 的 DNA，但通過瓊脂 糖凝膠電泳可以初步判斷得到的植物總 DNA 片段的大小； 根據(jù)蛋白質(zhì)、DNA 和 RNA 在 260nm/280nm 下的吸光值比值不同的，通過檢測(cè) DNA 樣品 260nm/280nm 下的吸光值比值可以初步判斷 DNA 樣品的純度。 3.限制性內(nèi)切酶與探針組合的選擇: 根

37、據(jù)導(dǎo)入植物中的外源基因的序列， 選擇合適的能夠區(qū)別出外源基因插入的拷貝數(shù)的探針/限制性內(nèi)切酶組 合 。 限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)（見基因操作原理） 4. 轉(zhuǎn)膜： 經(jīng)毛細(xì)管（毛細(xì)吸附）作用，把 DNA 從凝膠上轉(zhuǎn)到膜上。DNA 轉(zhuǎn)到膜上是 復(fù)制膠上的帶型，在 80-100真空干燥 0.5-4 hrs 或紫外鉸鏈儀中照射一定時(shí)間，即 可固定 DNA。 尼龍膜（帶正電荷的）強(qiáng)度高，不易破損，具有較大的 DNA 結(jié)合容量，它能夠吸 附變性 DNA，共價(jià)結(jié)合 DNA 是最大優(yōu)點(diǎn)，尼龍膜兩邊均有同樣吸附 DNA 功能， 可反復(fù)利用 10 次以上（10-20 次） 。尼龍膜根據(jù)探針標(biāo)記物不同，可以選擇的轉(zhuǎn)移 緩沖

38、液（transfer buffer）有高離子強(qiáng)度（10SSC 或 20SSC）的，也可用堿轉(zhuǎn)移 （0.5M NaOH） ，轉(zhuǎn)膜時(shí)間（duration of transfer）約 12 hrs，主要取決于轉(zhuǎn)膜時(shí)搭建 的毛細(xì)吸附系統(tǒng)、DNA 大小、膠厚度(5 mm)及濃度(0.7mM）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度（0.1-0.5mM NaCl）下 CTAB-核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等 仍溶解于溶液中。經(jīng)離心棄上清后，CTAB-核酸復(fù)合物再用 7075%酒精浸泡可洗 脫掉 CTAB。再經(jīng)過氯仿/異戊醇(24:1) 抽提去除蛋白質(zhì)、多糖、色素等來純化 DNA，最后

39、經(jīng)異丙醇或乙醇等 DNA 沉淀劑將 DNA 沉淀分離出來。 實(shí)驗(yàn)步驟： 采集適量幼嫩葉片，用液 N2 研成粉末，0.4 g 裝入 1.5ml 離心管中（注意：盡量 取材幼嫩葉片，如太老，酚類物質(zhì)多，必須用 10 mM 的 -ME 處理，研缽- 20預(yù)冷） 。 預(yù)熱 1.5CTAB 到 95，加 1ml 到裝有葉片粉末的離心管中，快速上下顛倒數(shù)次 混勻（注意：防止凍融） 。 立即置于 65水浴 30min，每 5 分鐘，上下顛倒 1 一次。 12000rpm 離心 5 分鐘。 吸取上清液約 600l 轉(zhuǎn)至一新 1.5ml 離心管，加入等體積（600l ）氯仿/ 異戊醇 (24:1)，輕輕地 上下

40、顛倒數(shù)次，至下層液相呈深綠色為止（注意：抽提時(shí)動(dòng)作應(yīng) 輕柔，轉(zhuǎn)移用的槍頭最好是剪寬了的） 。 12000rpm 離心 5 分鐘。 取 450l 上清于一新 1.5ml 離心管，加入 1ml 95%乙醇或無水乙醇和 45l 10M NH4AC） ，混勻，室溫放置 10min。 12000 rpm 離心 10min，吸去上清，用加 500l75% EtOH 乙醇浸洗沉淀 5-10 分鐘， 棄 75%乙醇，將管子放入離心機(jī)短暫離心，小心吸去殘留的乙醇，自然干燥約 30 min 吹干 DNA。 加入 50l 1/10 TE 或無菌水（含有 10g/ml 的 RNaseA） ，置于 4過夜，待 DNA

41、溶解后，檢測(cè) DNA 濃度及質(zhì)量。 注意事項(xiàng)： 1盡量取材幼嫩葉片，如太老，酚類物質(zhì)多，必須用 10 mM 的 -ME 處理 2研缽預(yù)凍，粉末至加 CTAB 前不要融化 324:1 的氯仿/異戊醇抽提時(shí)動(dòng)作應(yīng)輕柔，轉(zhuǎn)移用的槍頭最好是剪寬了的 4所用試劑必需滅菌，手套 21 思考： （1）DNA 降解的可能原因 （2）提高 DNA 產(chǎn)量的措施 實(shí)驗(yàn)二 二、總 DNA 質(zhì)量檢測(cè)及酶切 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模毫私庹莆諜z測(cè) DNA 質(zhì)量的方法以及 DNA 定量的方法；了解影響 DNA 在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)速率的因素；訓(xùn)練 DNA 的瓊脂糖凝膠電泳操作及 DNA 的限制性內(nèi)切酶操作。 實(shí)驗(yàn)原理：參見系列一中實(shí)驗(yàn)二；限

42、制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)：見“基因操作原理” 。 實(shí)驗(yàn)材料及試劑：水稻總 DNA 或 BAC 克隆 DNA；瓊脂糖；限制性內(nèi)切酶 DraI，EcoRI，EcoRV，HindIII 中的一種 實(shí)驗(yàn)步驟： 1取 1-5 l DNA 于 0.8% 凝膠電泳檢測(cè)； 2用紫外分光光度計(jì)測(cè)量 DNA 濃度 3. 將 DNA 調(diào)節(jié)濃度至 300-4500 ng/l ； 24 仔細(xì)閱讀將所使用的酶產(chǎn)品說明書，熟悉反應(yīng)條件及酶的貯存濃度（10U- 50U/l）廠家配套試劑； 35計(jì)算據(jù)反應(yīng)條件所需要的各種試劑準(zhǔn)確用量：（0.5 ml tube 中） DNA(3-5g) 10l 10 buffer reaction 1.

43、5l EnzymeHindIII (15 0U/l) 0.81l（冰上） ddH2O 2.7l 混勻，短暫離心； 437水浴或溫箱中 溫浴酶切 1-2 hrs (純 DNA) 或 10 hrs（粗制 DNA） ； 5加入 1/10 體積的 10上樣緩沖液終止酶切反應(yīng)，也可 65加熱 10 min 使酶變 性失活； 6 電泳檢測(cè)酶切效率： 每個(gè)樣品取 1/10 量體積的酶切產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測(cè)，制膠及點(diǎn)樣方法同上。 22 三、 電泳、轉(zhuǎn)膜 結(jié)果分析 若水稻 DNA 呈現(xiàn)均勻連續(xù)分布的一片，則酶切效果好，否則需重做； DNA 被切爛：DNA 降解，重新提 DNA； DNA 切不動(dòng)：雜質(zhì)多（多糖，蛋

44、白質(zhì)，酚類，有機(jī)溶劑等） ，重新純化； 若是 BAC 克隆 DNA，酶切后應(yīng)出現(xiàn)多條很清晰的不同大小 DNA 帶。 思考： 什么是酶星活性？如何避免？ 影響酶切效率的因素？ EB 指示劑原理？ 實(shí)驗(yàn)三 電泳、轉(zhuǎn)膜 轉(zhuǎn)膜是把 DNA 從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物（一般是尼龍膜）上固定， 是進(jìn)行各種后續(xù)研究（如 RFLP 分析，陽性克隆的篩選驗(yàn)證等所有涉及分子雜交的 研究）的前提。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆?Southern blotting 的原理及操作步驟 實(shí)驗(yàn)原理： 1. 轉(zhuǎn)膜的方式：一般采用向上的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移 2. 固相支持物的種類及選擇： 硝酸纖維素膜：非共價(jià)結(jié)合，易脆，易丟失 DNA，9，DNA

45、 不能與膜結(jié)合。 4轉(zhuǎn)膜時(shí)間（duration of transfer）約 12 hrs 取決于毛細(xì)管系統(tǒng)，DNA 大小，膠厚度(5 mm)及濃度(1%)。 實(shí)驗(yàn)材料：酶消化好的 DNA 樣品，尼龍膜 實(shí)驗(yàn)步驟： 鹽轉(zhuǎn)移： 23 1 瓊脂糖凝膠電泳 ： 制膠：注意瓊脂糖的質(zhì)量，膠的濃度，厚度（5mm）及均一性。大電泳槽一 般用 1TAE 配制 250ml 0.8%的瓊脂糖凝膠，注意瓊脂糖的質(zhì)量、膠的濃度、厚度 （ 3000Ci/mmol） ，30溫育 3 小時(shí)以上（同位素操作要要有安全防護(hù)設(shè)施） 。 。 28 雜交 將標(biāo)記好的探針，補(bǔ)加 300l 雜交液，100變性（or 0.4N NaOH

46、變性） ，加 入雜交袋（盒）中（忌直接加于膜上） 。雜交前作標(biāo)記效率測(cè)定，25%以上可以往 下做雜交， 過夜雜交。雜交效率受雜交速率及雜交穩(wěn)定性影響。 洗膜：從低嚴(yán)謹(jǐn)度到高嚴(yán)謹(jǐn)度冼膜液（具體情況而定）： 1SSC/0.1%SDS 洗膜兩次（冷 5min，熱 65，15min） 檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度 0.5SSC/0.1%SDS 熱冼 65, 15min 依情況可有改動(dòng) 0.2SSC/0.1%SDS or 0.1SSC/0.1%SDS。 包膜：膜從洗膜液中撈出，在濾紙上晾干，膜表面無可見水膜為止（注意：不能太 干，以防探針難以洗脫影響再次使用） ，用保鮮膜包膜，壓 X-光片，置于-20 或 -70 3

47、7 天（依據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱掌握曝光時(shí)間） 沖洗 X-光片 在暗室紅燈下取出 X-光片，置入顯影液中至雜交帶顯現(xiàn)出來（顯影時(shí)間依據(jù) 信號(hào)強(qiáng)弱及曝光時(shí)間長(zhǎng)短可由幾秒鐘到 2 分鐘） ，轉(zhuǎn)入清水中漂洗，然后放入定影 液中定影至清亮（約 10 分鐘） 。自來水沖洗干凈后，晾干，讀片。 膜上探針洗脫 再次使用膜前，必須洗去上次探針！ (1) 0.1%SDS，0.1SSC 10min (2) 0.1NaOH，0.2%SDS 2-3min (3) 0.2M Tris.HCL， 0.2%SDS，0.1SSC 20min 只洗去探針，而不影響膜上的靶 DNA（因?yàn)?DNA 與膜是共價(jià)鍵結(jié)合，而 DNA 與探針的結(jié)合是

48、氫鍵結(jié)合） 。 方法二 地高辛標(biāo)記探針的 Southern 雜交 （DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter Kit I ，Cat.No.11 745 832 910，Roche Diagnostics GmbH，Germany） 1. 探針標(biāo)記步驟（20l 體系）： 1) 將 10ng-1g 模板 DNA 用無菌去離子水補(bǔ)足至 16 l。 2) 沸水浴或干浴鍋 98 C 10 分鐘，使 DNA 變性成單鏈并迅速冰浴冷卻。 3) 充分混勻 DiG-high Primer （1#管） ，并取 4 l 至變性 DNA 管，混勻并離心。 2

49、9 4) 37 C 溫育 1 小時(shí)或過夜（最大到不超過 20 小時(shí)） 。 5) 停止反應(yīng)，加 2 l 0.2M EDTA（pH 8.0）或 65 C 加熱 10 分鐘。 2. 探針標(biāo)記效率檢測(cè)： 將地高辛標(biāo)記好的探針系列稀釋，點(diǎn)到一條尼龍膜上，同時(shí)用地高辛標(biāo)記的 control DNA 作對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，120 C 固定 30 分鐘；然后用地高辛抗體免疫檢測(cè)，按 BNT/BCIP 顯色步驟顯色； 比較顯色結(jié)果，選擇帶有可以接受的背景的最高探針濃度做正式的雜交。操作步驟如下： 1) 根據(jù)表 1 Dig-High Prime DNA 標(biāo)記及檢測(cè)試劑盒理想條件下探針的標(biāo)記產(chǎn)量將標(biāo)記 的探針稀釋到 1ng/

50、l，將試劑盒提供的 control DNA 稀釋到 1ng/l (原始濃度是 5ng /l)，然后按照表 2 系列稀釋探針及 control DNA 表 1 Dig-High Prime DNA 標(biāo)記及檢測(cè)試劑盒理想條件下探針標(biāo)記產(chǎn)量 Template DNA 1 h 20 h 。10 ng 45 ng 600 ng 30 ng 130 ng 1050 ng 100 ng 270 ng 1500 ng 300 ng 450 ng 2000 ng 1000 ng 850 ng 2300 ng 3000 ng 1350 ng 2650 ng 表 2 探針 DNA 及 Control DNA 系列表

51、 Tube DNA (l) From tube#DNA dilution buffer(l) Dilution Final concentration 1 Diluted orginal 1ng/l 2 2 1 198 1:100 10 pg/l 3 15 2 35 1:3.3 3 pg/l 4 5 2 45 1:10 1 pg/l 5 5 3 45 1:10 0.3 pg/l 6 5 4 45 1:10 0.1 pg/l 30 7 5 5 45 1:10 0.03 pg/l 8 5 6 45 1:10 0.01 pg/l 9 0 - 50 - 0 2) 將上述稀釋的 2-9 號(hào)管的 cont

52、rol DNA 及探針 DNA 各取 1l 點(diǎn)膜 3) 120C 固定 30 分鐘或紫外交鏈 3-5 分鐘 4) 將膜放入裝有 20ml Maleic acid buffer 的塑料器皿中，室溫 2 分鐘 5) 將膜放入 10ml Blocking solution 中室溫溫育 30 分鐘 6) 將膜放入 10ml Antibody solution 中室溫溫育 30 分鐘 7) 用 10ml Washing buffer 洗 2 次，每次 15 分鐘 8) 在 10ml Detection buffer 平衡 2-5 分鐘 9) 將膜放入 2ml 新配制的 Color substrate s

53、olution 中暗室條件下顯色。顯色過程中 不要搖動(dòng) 10) 當(dāng)斑點(diǎn)或帶顯示出來后，用 50ml 滅菌的雙蒸水洗膜 5 分鐘，照相 染色至 0.1pg 的 Control DNA 出現(xiàn)斑點(diǎn)，比較標(biāo)記的探針與 Control DNA 染色情況計(jì)算出 地高辛標(biāo)記的 DNA 的量：如果 0.1pg 的探針及對(duì)照稀釋點(diǎn)都顯色，則探針標(biāo)記理想；如果 0.1pg 的對(duì)照顯色， 0.1pg 的標(biāo)記探針沒顯色，但 0.3pg 顯色，則計(jì)算探針濃度（約為理想濃 度的 1/3）以確定雜交時(shí)加多少探針（25ng 探針/ml 雜交液） ；如果 0.1pg 的對(duì)照顯色，但標(biāo)記 探針 0.3pg 的斑點(diǎn)沒顯色，則應(yīng)重新

54、標(biāo)記探針。 3. 預(yù)雜交和雜交 準(zhǔn)備：（1）DiG Easy Hyb：將 64ml 無菌去離子水分兩部分倒入試劑 7#瓶，37C 搖動(dòng)溶解 5 分鐘；（2）計(jì)算雜交溫度：通常為 37C-42C，T m=49.82+0.41(%G+C)- (600/I)(I=length of hybrid in base pairs)。T opt.=Tm-20 to 25 C 預(yù)熱一定體積的 DiG Easy Hyb（10ml/100cm2 膜）至雜交溫度 37-42 C。注： 先將洗干凈的雜交筒放入雜交爐中預(yù)熱，使筒蓋膨脹，并且在后續(xù)步驟中加 入雜交液時(shí)，將瓶蓋始終放在爐中，防治液體泄漏 預(yù)雜交 30 分鐘

55、。在不加探針的情況下，僅將膜放在雜交液中 42C 下充分潤(rùn)濕 變性：Dig 標(biāo)記的探針（約 25ng/ml）置沸水浴或 98C 干浴鍋中 5 分鐘后迅速 放在冰上冷卻。 （不能用堿變性?。?將變性的探針加入預(yù)熱的 DIG Easy Hyb（3.5ml/100cm2）中，混勻，避免泡沫 31 倒出預(yù)雜交液，加入探針和 DIG Easy Hyb 混合液 繼續(xù)在 42 C 下雜交 6h 至過夜。注：含有探針的 DiG Easy Hyb 雜交液可重復(fù) 利用，雜交結(jié)束后用槍吸出放入 1.5ml 離心管中于-20C 保存，可重復(fù)使用 幾次，只需在使用前于 68C 處理 10 分鐘即可。 洗膜 用 2SSC

56、 ，0.1% SDS 在 15-25C 冷洗 2 次，每次 5 分鐘，洗滌過程中要輕輕 搖動(dòng) 用 0.5SSC，0.1% SDS 在 65 -68C 雜交管中熱洗 2 次，每次 15 分鐘。 5. 檢測(cè)（注意：為避免膜變干，在下一步試劑準(zhǔn)備好之前不要將上一步的試劑倒 掉） 1) 雜交和洗膜后，用 Maleic acid buffer 浸泡 1-5 分鐘 2) 準(zhǔn)備 1Block solution： 用 Maleic acid buffer 10稀釋試劑 6#（10Blocking solution ） ，成 1的工作液，即每 9ml Maleic acid buffer 中加入 1ml 10B

57、locking solution 混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用 3) 按 1ml/ cm2 的量取用 1Block solution，處理膜 30 分鐘 4) 將 4#試劑離心，按 1：5000 或 1：10000 加入 1Blocking solution，2-8 C 可放 12 小時(shí)（每 10ml 1Blocking solution 加 1ul Ab 抗體即可） 5) 按 20 ml/100 cm2 的量用 antibody solution 處理膜 30 分鐘 6) 每次按 1ml/ cm2 的量用 Washing buffer 洗膜 2 次，每次 15 分鐘 按 20 ml/100 cm2 的用量

58、，膜在 detection buffer 中平衡 2-5 分鐘 8) 準(zhǔn)備 Color-substrate solution（顯色液）：從試劑 5#中取 100ul 到 5ml Detection buffer，要避光，現(xiàn)配現(xiàn)用 9) 按 10ml/100cm2 的量加入新鮮配制的 color solution 浸潤(rùn)膜，放在塑料袋或 塑料盒中，保持黑暗，注意不要在顯色過程中搖動(dòng) 10) 顏色沉淀在幾分鐘內(nèi)開始出現(xiàn)，在 16 小時(shí)內(nèi)完成顯色反應(yīng)，在顯色過程 中膜可在光亮處短暫暴露幾次。當(dāng)預(yù)期的斑點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)，可在 50mlTE 或無 菌超純水中洗膜 5 分鐘中止反應(yīng) 11) 照像記錄結(jié)果。 雜交膜的

59、再生 雜交后的膜必須保持濕潤(rùn)，否則再生效果會(huì)受影響。以下操作必須在通風(fēng)櫥中 進(jìn)行： 32 將水浴鍋調(diào)到 50-60C 將膜放入燒杯中，加入 DMF 濕潤(rùn)后，置于水浴鍋中，不斷搖晃。期間要換幾次 DMF，直到藍(lán)色消失 用去離子水洗膜 在 37C 條件下，用 0.2M NaOH， 0.1% SDS 的洗膜液洗兩次，每次 15 分鐘 用 2SSC 平衡，可以直接用來預(yù)雜交和雜交（如果暫時(shí)不用，可將膜浸在 2SSC 或馬來酸溶液（Maleic acid buffer）中保持濕潤(rùn)，直到再次使用） 。 33 附注： 1. 雜交率的影響因素 雜交溫度：雙鏈 DNA 分子，T=T m-2025可達(dá)最大雜交率，

60、DNA-RNA 雜交分 子則低于 Tm 值 10-15。 離子強(qiáng)度(1.5M/L NaCl 雜交率最高 ) 雙鏈長(zhǎng)度(形成雜交物長(zhǎng)度) ：雜交率與雙鏈長(zhǎng)度成正比 探針的復(fù)雜程度 (重復(fù)性探針可以增加雜交率) pH5.0-9.0 基本無影響。 2. 影響雜交穩(wěn)定性（影響解鏈溫度的）因素 離子強(qiáng)度 在 0.01-0.4M NaCl 之間, 每10單價(jià)陽離子，Tm16.6 堿基組成 AT500bp 基本無影響 3整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)注意的事項(xiàng)： 保證轉(zhuǎn)膜質(zhì)量； 操作規(guī)范； 提高雜交靈敏度（信號(hào)強(qiáng)度） ； 探針量及標(biāo)記量（探針變性） ； 比活（性）度 =108dpm/g(1000bp ）過長(zhǎng)，高嚴(yán)謹(jǐn)度下難

61、洗脫非完全配對(duì)雜交探針。 4放射性同位素： 34 放射性同位素發(fā)出的射線主要有： 粒子：外照射，一般能量的 粒子穿透能力較弱，射程短，危害性小，稍 加防護(hù)即可（如手套） ；內(nèi)照射，電離密度大，危害大。 粒子：穿透能力比 粒子強(qiáng)，外照射危害比 粒子大，可引起皮膚的放射 損傷。 射線：穿透能力很強(qiáng)，外照射時(shí)危害性很大，應(yīng)采取切實(shí)有效的防護(hù)措施。 放射性活度及單位： 放射性活度 A 是指一定量的放射性核素在時(shí)間間隔 dt 內(nèi)發(fā)生自發(fā)核衰變數(shù) dN 與此時(shí)間間隔的比值。即 A=dN/dt 放射性活度的單位是 Becquerel(貝克勒而)，簡(jiǎn)稱 Bq。 1Bq=1 個(gè)衰變/秒；1 居里=3.710 1

62、0Bq 其不表示放射出射線的多少（如 60Co 一個(gè)原子衰變防出 1 個(gè) 粒子和一個(gè)光 子，而一個(gè) 32P 原子只衰變出一個(gè) 粒子） ，也不表示射線能量的大小。 輻射防護(hù)的目的: 防止發(fā)生對(duì)健康有害的確定性效應(yīng)(接受放射性治療的患者除外), 并將隨機(jī)性損害 效應(yīng)的發(fā)生降低到被認(rèn)為可以接受的水平，從而保障放射工作人員、公眾及其后代 的健康與安全，提高放射防護(hù)措施的效益，促進(jìn)放射工作的發(fā)展。 放射防護(hù)的原則： 輻射實(shí)踐的正當(dāng)化：生產(chǎn)必須，醫(yī)療必須，科研教學(xué)必須 輻射防護(hù)的最優(yōu)化：即綜合考慮社會(huì)、經(jīng)濟(jì)等諸因素之后，使個(gè)人受照劑量的大小、 受照人數(shù)的多少和不確定發(fā)生的照射事件的發(fā)生概率達(dá)到合理的低水平

63、。 個(gè)人劑量限制：為了保證每個(gè)人不致受到不合理的危害，必須制定一個(gè)個(gè)人劑量限 制值，放射工作人員的劑量限制：全身均勻照射的年當(dāng)量劑量限值 H 全身 =50mSV; 不均勻照射時(shí)，有效劑量 E 不應(yīng)超過 H 全身 。 外照射的防護(hù)措施： 距離防護(hù)：人體受到照射的劑量率隨著離開電離輻射源的距離的增大而減少。劑量 率與距離的平方成反比。 時(shí)間防護(hù)：在劑量率不變時(shí)，劑量與時(shí)間成正比，即操作時(shí)間越短，人員所受到的 照射劑量越小。 （ 要求放射性作業(yè)應(yīng)操作熟練、操作步驟應(yīng)盡量簡(jiǎn)單易行，盡量減 少在輻射場(chǎng)所逗留的時(shí)間。 ） 屏蔽防護(hù)：利用射線通過物質(zhì)時(shí)，與物質(zhì)相互作用使其能量被物質(zhì)吸收而逐漸減弱 的原理，可

64、以設(shè)置一定的屏障物來進(jìn)行防護(hù)。常用的材料有水、磚、大理石、混凝 土、重金屬鉛等。 35 利用衰變：可利用放射性物質(zhì)存在自發(fā)衰變，其活性隨之減少的原理進(jìn)行外照射防 護(hù)。如：半衰期小于 15 天的放射性廢物，允許放置 10 個(gè)半衰期后作一般廢物處理。 內(nèi)照射的防護(hù)措施 防止放射性物質(zhì)經(jīng)呼吸道吸入 防止放射性物質(zhì)食入 防止放射性物質(zhì)經(jīng)體表進(jìn)入 36 系列三 表達(dá)檢測(cè) 在轉(zhuǎn)錄水平上研究和了解基因的表達(dá)與調(diào)控是分子生物學(xué)和基因操作的重要 內(nèi)容。Northern 雜交可以測(cè)定總 RNA 或 poly(A)+ RNA 中特定 mRNA 分子的大小和 表達(dá)豐度，RNA 分子在變性瓊脂糖凝膠中電泳，按其分子的大

65、小分開，然后將 RNA 轉(zhuǎn)至尼龍膜或硝酸纖維素膜上，經(jīng)過體外鉸鏈固定，用放射性同位素標(biāo)記的 DNA 或 RNA 探針與之雜交，放射自顯影后即可以得到待測(cè)基因 RNA 表達(dá)水平的情況； RT-PCR 以 mRNA 反轉(zhuǎn)錄生成的 cDNA 作為 PCR 的模板進(jìn)行擴(kuò)增，比 Northern 雜 交更靈敏，對(duì) RNA 的質(zhì)量要求較低，操作簡(jiǎn)便，它是在轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)基因時(shí)空 表達(dá)的常用方法。 實(shí)驗(yàn)一 RNA Extraction (mini prep) RNA 的制備與分析對(duì)于了解基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)與調(diào)控和 cDNA 的合成 都是必須的，RNA 的純度和完整性對(duì)于 Northern blot， R

66、T-PCR 和 cDNA 文庫的構(gòu) 建等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)都至關(guān)重要。RNA 分離的方法很多，其中最關(guān)鍵的因素是防 止 RNA 酶的污染。操作過程要非常小心，涉及到的所有器皿、用具最好專用，且 必須經(jīng)過特殊處理或高溫烘烤；配制試劑采用 DEPC 處理過的水等。 方法一：氯化鋰沉淀法 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí) RNA 的簡(jiǎn)易制備過程，通過 RNA 電泳帶評(píng)價(jià) RNA 質(zhì)量 實(shí)驗(yàn)材料：水稻幼嫩葉片 實(shí)驗(yàn)原理：SDS 是一種去污劑，可以抑制內(nèi)源 RNA 酶的活性，它不但可解聚核酸 與蛋白質(zhì)的結(jié)合，還可與蛋白質(zhì)帶正電荷的側(cè)鏈結(jié)合，形成 SDS蛋 白質(zhì)復(fù)合物而沉淀。4 M LiCl 可選擇性沉淀 RNA。 實(shí)驗(yàn)步驟： Harvest fresh leaf discs in 2 ml eppendorf tubes and freeze quickly in liquid nitrogen and store at -80C until use. Grind leaf discs using a steel bar (precooled in liquid nitrogen) that perfectly fi