慢病毒使用操作指南

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1、慢病毒使用操作指南 一、慢病毒的儲存與稀釋： 1. 病毒的儲存：用戶收到病毒液后在很短時間內(nèi)即使用慢病毒進行實驗，可以 將病毒暫時放置于 4 ℃ 保存； 如需長期保存請放置于 -80 ℃（病毒置于凍存管， 并使用封口膜封口） 注： A ．病毒可以存放于 -80 ℃ 6 個月以上；但如果病毒儲存時間超過 6 個月， 我們建議在使用前需要重新滴定病毒滴度。 B ．反復(fù)凍融會降低病毒滴度：每次凍融會降低病毒滴度 10% ；因此在病毒使用 過程中應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融， 為避免反復(fù)凍融我們強烈建議客戶收到病毒后按照 每次的使用量進行分裝。 2. 病毒的稀釋：用戶需要稀釋病毒時，請將病毒

2、取出置于冰浴融解后，使用培 養(yǎng)目的細胞用 PBS 或無血清培養(yǎng)基 （含血清或含雙抗不影響病毒感染 ）混勻分裝 后 4 ℃ 保存 （請盡量在三天內(nèi)用完 ），分裝后使用。 二、慢病毒用于體外（ in vitro ）實驗：感染培養(yǎng)原代細胞和建系細胞 1. 慢病毒對各種細胞和組織的親嗜性不同，用戶使用 Invabio 提供的慢病毒之 前可以通過查閱相關(guān)文獻，了解慢病毒對您的目的細胞的親嗜性，感染復(fù)數(shù) （ MOI 值）以及在體內(nèi)（ in vivo ）注射所需要的病毒量。如果沒有相關(guān)文獻 支持，可以通過感染預(yù)實驗得到合適的感染復(fù)數(shù)（ MOI 值）（使用 24 孔板檢 測病毒對目的細胞的親嗜

3、性） 2. 慢病毒感染目的細胞預(yù)實驗 ① 慢病毒感染目的細胞預(yù)實驗注意事項 A ． 測定慢病毒對目的細胞的親嗜性時，需要同時設(shè)置對慢病毒親嗜性較高的 （HEK293T ， Hela） 細胞作為平行實驗的對照細胞。 B ．在進行慢病毒感染實驗時 ,可以用完全培養(yǎng)基（培養(yǎng)目的細胞用）稀釋；理論 上，含有血清、雙抗或者其他營養(yǎng)因子的完全培養(yǎng)基不影響慢病毒的感染效率。 C． Invabio 提供的病毒單位為 TU/ml ，即每毫升中含有具有生物活性的病毒顆 粒數(shù)。如：病毒滴度為 >1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有 1X108 個 具有生物活性的慢病毒顆粒。 ② 以

4、24 孔培養(yǎng)板為例，進行目的細胞和 HEK293T 細胞的感染預(yù)實驗 實驗前按照不同的 MOI 設(shè)置不同的感染孔， 并根據(jù) MOI 和細胞數(shù)量計算所需要 的病毒量，如有必要可以使用 PBS 溶液或者無血清培養(yǎng)基稀釋病毒原液 第一天，準備細胞：在 24 孔培養(yǎng)板接種若干孔，每個孔內(nèi)接種 3~5X104 個目 的細胞，鋪板時細胞的融合率為 50%左右，每孔培養(yǎng)基體積為100 屋；進行 病毒感染時細胞的融合度約為 70%左右。 第二天，觀察細胞生長狀態(tài)，如細胞狀態(tài)較好則開始實驗： 1 、取出 4 ℃ 保存的病毒，使用臺式離心機離心 20 秒（使病毒完全懸于離心管 底部即可）；如果是凍

5、存在 -80℃的病毒需要先在冰上融化后使用。亦可以根據(jù) 實驗室的實際情況將按照 MOI 準確計算好的慢病毒稀釋到培養(yǎng)基中，并盡可 能保證所獲得的含有慢病毒的培養(yǎng)基的總體積為最小體積， 以期獲得最佳的感染 效率。 2、病毒準備好之后，從培養(yǎng)箱中拿出細胞， a 使用移液器吸取準確體積的病毒液加入準備好的培養(yǎng)基 b 吸去原細胞培養(yǎng)器皿中的培養(yǎng)基（如果細胞生長良好，密度適宜，則不用換 液） c 在目的細胞和對照細胞中分別加入計算好的病毒液 d 混勻后放于二氧化碳培養(yǎng)箱（ 37℃、 5%CO2 ）孵育過夜 注： 感染前細胞的狀態(tài)好壞對最終的感染效果高低影響很大， 所以務(wù)必保證加病

6、毒之前，細胞處于良好的生長狀態(tài)。 如果慢病毒對目的細胞的感染效率偏低，則可以通過提高 MOI 值來增加其感 染效率，但是當 MOI 高于 20 時，我們建議客戶在培養(yǎng)基中加入 ploybrene （8①g/ml左右）來提高病毒的感染效率。 第三天，更換培養(yǎng)液：一般在 24 小時候后將含有慢病毒的培養(yǎng)液更換成正常培 養(yǎng)液； 在感染后觀察細胞狀態(tài)， 如果慢病毒對細胞有明顯毒性作用而影響細胞生 長狀態(tài)，可以最短在加病毒 4 小時候更換新鮮培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)（建議在 8-12 小時更換為宜）。第一次換液后，如果慢病毒對細胞沒有明顯毒性作用，按照正 常培養(yǎng)條件培養(yǎng)換液。 第六天， 感染效

7、率檢測： 在倒置熒光顯微鏡觀察熒光， 估計慢病毒感染目的細胞 的效率；如何由于目的基因較大而造成選擇的載體不能攜帶 Marker Gene 的， 可以通 Real-time RT-PCR 檢測目的基因的表達來拍評估感染效率。 三、慢病毒使用注意事項 1. 病毒操作時最好使用生物安全柜。如果使用普通超凈工作臺操作病毒，請不 要打開排風(fēng)機。 2. 病毒操作時請穿實驗服，帶口罩和手套。 3. 操作病毒時特別小心不要產(chǎn)生氣霧或飛濺。 如果操作時超凈工作臺有病毒污 染，請立即用 70% 乙醇加 1% 的 SDS 溶液擦拭干凈。接觸過病毒的槍頭，離 心管，培養(yǎng)板，培養(yǎng)液請于 84 消毒液

8、或 1%SDS 中浸泡過夜后棄去。 4. 用顯微鏡觀察細胞感染情況時應(yīng)遵從以下步驟：擰緊培養(yǎng)瓶或蓋緊培養(yǎng)板。 用 70% 乙醇清理培養(yǎng)瓶外壁后到顯微鏡處觀察拍照。離開顯微鏡實驗臺之前， 用 70% 乙醇清理顯微鏡實驗臺。 5. 如需要離心，應(yīng)使用密封性好的離心管，或者用封口膜封口后離心，而且盡 量使用組織培養(yǎng)室內(nèi)的離心機。 6. 脫掉手套后，用肥皂和水清洗雙手。 四、懸浮細胞感染簡單步驟 1. 根據(jù)細胞的量將細胞在 1.5ml 管中離心收集然后用 100-200ul 的無血清 培養(yǎng)液稀釋細胞沉淀，以細胞完全浸沒在培養(yǎng)基中為準 2. 按照 MOI 換算病毒顆粒數(shù)量，吸取病毒液加入細胞中，將 1.5ml 管放在 37℃度培養(yǎng)箱中孵育 30 分鐘 3. 將管中混合溶液吸出加到培養(yǎng)皿中或孔里 4. 加入足夠量的新鮮培養(yǎng)液 5. 12 小時后換液 6. 96 小時后觀察細胞陽性率 精品資料 精品資料 Welcome To Download !!! 歡迎您的下載，資料僅供參考！ 精品資料