武漢大學(xué)分析化學(xué)課件第20章高效液相色譜法

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1、高壓、高速的現(xiàn)代高效液相色譜儀于高壓、高速的現(xiàn)代高效液相色譜儀于1967年面世，年面世，導(dǎo)致高效液相色譜法導(dǎo)致高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)的產(chǎn)生。的產(chǎn)生。 薄殼型填料，柱效僅每米10003000塔板數(shù)510m球型和無定型微粒硅膠，每米56萬理論塔板數(shù) 鍵合相色譜、離子色譜、疏水色譜、親和色譜、手性色譜、脂質(zhì)體色譜、生物膜色譜、整體柱色譜、微徑柱和毛細(xì)管柱色譜及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等 高壓、高速的現(xiàn)代高效液相色譜儀于高壓、高速的現(xiàn)代高效液相色譜儀于1967年面世，年面世，導(dǎo)致高效液相色譜法導(dǎo)致高效液相色譜法(high-pe

2、rformance liquid chromatography，HPLC)的產(chǎn)生。的產(chǎn)生。 薄殼型填料，柱效僅每米10003000塔板數(shù)510m球型和無定型微粒硅膠，每米56萬理論塔板數(shù) 高度均勻甚至單分散13m硅膠基質(zhì)球形填料，達(dá)1530萬理論塔板/m。 新型分離模式和方法不斷增加 高壓、高速的現(xiàn)代高效液相色譜儀于高壓、高速的現(xiàn)代高效液相色譜儀于1967年面世，年面世，導(dǎo)致高效液相色譜法導(dǎo)致高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography，HPLC)的產(chǎn)生。的產(chǎn)生。 薄殼型填料，柱效僅每米10003000塔板數(shù)510m球型和無定型微粒硅膠，每米56

3、萬理論塔板數(shù) 高度均勻甚至單分散13m硅膠基質(zhì)球形填料，達(dá)1530萬理論塔板/m。 新型分離模式和方法不斷增加 基本特點(diǎn)基本特點(diǎn) 1. 高效、高速、高靈敏度 2. 填料粒徑和流動相性質(zhì)影響色譜柱效 3局限性 操作條件操作條件 1. 流動相對分離選擇性的影響 2. 柱外效應(yīng) 3. 操作壓力 適用范圍廣適用范圍廣1. 1. 吸附色譜吸附色譜(adsorption Chromatography)(adsorption Chromatography)2. 2. 分配色譜分配色譜(partition Chromatography) (partition Chromatography) 3. 3. 離子交

4、換色譜離子交換色譜(ion-Exchange Chromatography) (ion-Exchange Chromatography) 4. 4. 體積排阻色譜體積排阻色譜(size Exclusion Chromatography)(size Exclusion Chromatography) 需要指出的是每種色譜方法通常存在一種起支配作需要指出的是每種色譜方法通常存在一種起支配作用的主要保留機(jī)理，但可能還存在次要的其他機(jī)理。用的主要保留機(jī)理，但可能還存在次要的其他機(jī)理。 根據(jù)固定相和液體流動相相對極性的差別，有正相色譜和反相色譜兩種色譜體系或方法。 反相色譜和正相色譜主要區(qū)別是流動相和固

5、定相的相對極性，最初形成于液液分配色譜，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于其他各種色譜方法。 上述每種色譜類型均可進(jìn)一步分為多個(gè)不同色譜方上述每種色譜類型均可進(jìn)一步分為多個(gè)不同色譜方法。這些方法可用于分析分離，也可用于制備分離，各法。這些方法可用于分析分離，也可用于制備分離，各色譜方法在相關(guān)領(lǐng)域應(yīng)用互相補(bǔ)充。色譜方法在相關(guān)領(lǐng)域應(yīng)用互相補(bǔ)充。 現(xiàn)代高效液相色譜使用310m柱填料，為達(dá)到適用的流動相流速，高壓泵需提供幾十MPa或數(shù)百大氣壓力的柱前壓。因而HPLC儀器比其他類型的色譜儀要復(fù)雜和昂貴。1,2,3,-流動相溶劑儲器；4,5,6,-過濾器；7溶劑比例調(diào)節(jié)閥和混合室；8輸液泵；9脈動阻尼器；10放空閥；11過濾

6、器；12反壓控制器；13進(jìn)樣閥；14色譜柱；15檢測器。 現(xiàn)代高效液相色譜儀配備一或多個(gè)流動相儲液器，一般為玻璃瓶，亦可為耐腐蝕的不銹鋼、氟塑料或聚醚醚酮(PEEK)特種塑料制成的容器。每個(gè)儲瓶容積5002000mL。儲液瓶位置要高于泵體，以保持一定的輸液靜壓差，在泵啟動時(shí)易于讓殘留在溶劑和泵體中微量氣體通過放空閥排出。 儲器常裝有脫除溶劑中溶解的氧、氮等氣體裝置，這些溶解氣可能形成氣泡引起譜帶展寬，并干擾檢測器正常工作。溶劑脫氣主要有兩種方法，其一是攪拌下真空或超聲波脫氣；另一種是通入氦或氮等惰性氣體帶出溶解在溶劑中空氣。儲液器的溶劑導(dǎo)管入口處裝有過濾器，以進(jìn)一步除去溶劑中灰塵或微粒殘?jiān)?，?/p>

7、止損壞泵、進(jìn)樣閥或堵塞色譜柱。 通用HPLC儀輸液泵系統(tǒng)的基本要求是：提供(50-500)105Pa的柱前液壓；輸出無脈動恒定的液流；流速范圍0.1-10mL/min；流速控制精度0.5%或更好；系統(tǒng)組件耐腐蝕(密封性良好的不銹鋼或氟塑料)。高壓泵產(chǎn)生的液體高壓沒有爆炸危險(xiǎn)，因?yàn)橐后w的壓縮性極小。最重要的是系統(tǒng)密封性能好。 目前常使用的有三種類型的輸液泵，即往復(fù)柱塞泵、氣動放大泵、螺旋注射泵，它們各有優(yōu)、缺點(diǎn)。1.1.往復(fù)柱塞泵往復(fù)柱塞泵 1.電機(jī)，2.往復(fù)凸輪，3.密封柱塞，4.吸排液單向閥，5.溶劑入口，6.脈動阻尼器,7.接色譜柱。2. 2. 其他類型泵其他類型泵 氣動放大泵又稱為恒壓泵

8、，其工作原理與水壓機(jī)相似，以低壓氣體作用在大面積氣缸活塞上，壓力傳遞到小面積液缸活塞，利用壓力放大獲得高壓。 螺旋注射泵又稱為排代泵，其結(jié)構(gòu)類似于醫(yī)用注射器，由一個(gè)大體積液體室和柱塞組成，步進(jìn)電機(jī)通過螺旋桿傳動機(jī)構(gòu)推動柱塞輸出高壓液體。3.3.流速控制和程序系統(tǒng)流速控制和程序系統(tǒng) 比例調(diào)節(jié)閥和混合器；脈動阻尼器；放空閥；過濾器；反壓控制傳感器等。 高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約530cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相

9、色譜法中對進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。 進(jìn)樣閥進(jìn)樣閥動 畫 色譜柱是液相色譜的色譜柱是液相色譜的心臟部件心臟部件，它包括柱管與固定，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管滑的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長用得較多。一般色譜柱長5 530cm30cm，內(nèi)徑為，內(nèi)徑為4 45mm5mm，凝，凝膠色譜柱內(nèi)徑膠色譜柱內(nèi)徑3 312mm12mm，制備往內(nèi)徑較大，可達(dá)，制備往內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm 25mm 以以上。上。一般在分離前備有一個(gè)前置柱，前置柱內(nèi)填充

10、物和一般在分離前備有一個(gè)前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時(shí)不再洗脫其中其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時(shí)不再洗脫其中固定相，保證分離技的性能不受影響。固定相，保證分離技的性能不受影響。 按內(nèi)徑大小可大致分為常規(guī)分析柱、制備或半按內(nèi)徑大小可大致分為常規(guī)分析柱、制備或半制備柱、小內(nèi)徑或微徑柱、毛細(xì)管柱四種類型。制備柱、小內(nèi)徑或微徑柱、毛細(xì)管柱四種類型。 一般在分析柱前裝上較短的保護(hù)柱，不僅可除一般在分析柱前裝上較短的保護(hù)柱，不僅可除去溶劑中的顆粒雜質(zhì)和污染物，而且可除去樣品中

11、去溶劑中的顆粒雜質(zhì)和污染物，而且可除去樣品中含有與固定相不可逆結(jié)合的組分，以保護(hù)較昂貴的含有與固定相不可逆結(jié)合的組分，以保護(hù)較昂貴的分析柱，延長使用壽命。分析柱，延長使用壽命。 對色譜柱嚴(yán)格控制溫度可獲得重現(xiàn)性更高保留對色譜柱嚴(yán)格控制溫度可獲得重現(xiàn)性更高保留值和更好分離色譜圖。值和更好分離色譜圖。 根據(jù)填料粒徑大小采用干法或濕法裝柱。粒徑大根據(jù)填料粒徑大小采用干法或濕法裝柱。粒徑大于于20m，采用類似氣相色譜的干法裝柱，實(shí)際上這種，采用類似氣相色譜的干法裝柱，實(shí)際上這種方法己很少使用。方法己很少使用。 目前大多數(shù)采用目前大多數(shù)采用10m以下填料，以稱為等密度勻以下填料，以稱為等密度勻漿濕法裝柱

12、。漿濕法裝柱。注:1.高壓泵，2.壓力表，3.排空氣閥，4.勻漿罐，5.色譜柱，6.加壓介質(zhì)瓶，7.廢液杯。 在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測器。一類是溶質(zhì)性檢測器，它僅對被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測器等。另一類是總體檢測器，它對試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測器的有示差折光，電導(dǎo)檢測器等?，F(xiàn)將常用的檢測器介紹如下:l. 光吸收檢測器：光吸收檢測器：紫外吸收檢測器，光二極紫外吸收檢測器，光二極管陣列檢測器，紅外吸收檢測器管陣列檢測器，紅外吸收檢測器2. 熒光檢測器熒光檢測器 3. 示差折光率檢測器示差折光率檢測器4. 蒸發(fā)光散射

13、檢測器蒸發(fā)光散射檢測器5. 電化學(xué)檢測器電化學(xué)檢測器 1. 紫外吸收紫外吸收(UV) 檢測器檢測器 應(yīng)用最廣，對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。應(yīng)用最廣，對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。 特點(diǎn)：特點(diǎn)：靈敏度高；線形范圍高；流通池可做的很?。?mm 10mm ，容積 8L）；對流動相的流速和溫度變化不敏感；波長可選，易于操作；可用于梯度洗脫。 紫外檢測器的重要進(jìn)展；紫外檢測器的重要進(jìn)展； 光電二極管陣列檢測器：光電二極管陣列檢測器：1024個(gè)二極管陣列，各個(gè)二極管陣列，各檢測特定波長，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如檢測特定波長，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。圖所示。3. 紅外吸收檢測器紅外吸收檢測

14、器 與一般光吸收檢測器光路設(shè)計(jì)相似，其吸收池窗與一般光吸收檢測器光路設(shè)計(jì)相似，其吸收池窗口采用氯化鈉、氟化鈣等紅外透明材料，透過吸收池口采用氯化鈉、氟化鈣等紅外透明材料，透過吸收池的紅外光一般以熱電敏感元件接收。這種檢測器可提的紅外光一般以熱電敏感元件接收。這種檢測器可提供分子結(jié)構(gòu)信息，但由于大多數(shù)液相色譜流動相溶劑供分子結(jié)構(gòu)信息，但由于大多數(shù)液相色譜流動相溶劑都有紅外吸收及窗口材料限制，其應(yīng)用有限。都有紅外吸收及窗口材料限制，其應(yīng)用有限。 對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng). 除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器； 可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動

15、相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比； 通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）； 靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫； 偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；1.色譜柱出口;2.液壓釋放口;3.氮?dú)馊肟?4.霧化器;5.加熱漂移管;6.樣品液滴;7.激光光源;8.排氣口;9.光電檢測器;10.放大器;11.連接記錄系統(tǒng)。A.色譜柱洗出液霧化區(qū)；B.溶劑蒸發(fā)區(qū);C.樣品粒子光散射。 基于電化學(xué)原理和物質(zhì)的電化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行檢測，主要有安培、極譜及電導(dǎo)等幾種類型，適用于測定具有電化學(xué)氧化還原性質(zhì)及電導(dǎo)的化合物，如含硝基、氨基等有機(jī)化合物及無機(jī)陰、陽離子等。1.氟塑料池體,2.工作電極,3.氟塑料或聚酯

16、墊片,4.接參比電極，至廢液，5.接色譜柱。 20.3.1. 高效液相色譜固定相高效液相色譜固定相 高效液相色譜固定相以承受高壓能力來分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.O1081.O109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團(tuán)，就是鍵合固定相，可擴(kuò)大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成。可承受壓力上限為3.5108Pa。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。 由于高效液相色譜中流動相是液體，它對組分有親和力，并參與固定相

17、對組分的競爭。因此，正確選擇流動相直接影響組分的分離度。對流動相溶劑的要求是：1.1.化學(xué)惰性，化學(xué)惰性，不與固定相和被分離組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，保證柱的穩(wěn)定性和分離的重現(xiàn)性。2.2.適用的物理性質(zhì)，適用的物理性質(zhì)，包括沸點(diǎn)較低，以便于分離組分和溶劑回收;低粘度，利于提高傳質(zhì)速率和分離速度、降低柱前壓;弱或無紫外吸收等，以降低UV檢測器本低響應(yīng)，提高檢測靈敏度;對樣品具有適當(dāng)溶解能力等。3.3.溶劑清洗和更換方便，毒性小、純度高、價(jià)溶劑清洗和更換方便，毒性小、純度高、價(jià)廉等，便于操作和安全。廉等，便于操作和安全。1.溶劑強(qiáng)度參數(shù)0定義為溶劑分子在單位吸附劑表面積上的吸附自由能，表征溶劑分子對吸附劑

18、的親和力大小。2.溶解度參數(shù)它是溶劑與溶質(zhì)分子間各種作用力的總和，包括色散力、偶極作用力、接受質(zhì)子能力、給于質(zhì)子能力等。3.極性參數(shù)P表示每種溶劑與乙醇、二氧六環(huán)和硝基甲烷三種極性物質(zhì)相互作用力的度量，類似于氣相色譜固定液的Rohrschneider常數(shù)，反映溶劑接受質(zhì)子、給出質(zhì)子和偶極相互作用能力及選擇性差異，亦作為表征溶劑洗脫強(qiáng)度的指標(biāo)。 優(yōu)化保留值k和分離選擇性的重要方法是改變流動相溶劑類型和組成。 溶劑組成優(yōu)化用差試法比較麻煩、費(fèi)時(shí)，成功率不一定很高。采用溶劑組成與溶劑強(qiáng)度參數(shù)關(guān)系的估算,可減少優(yōu)化實(shí)驗(yàn)操作。二元混合溶劑極性參數(shù)P與其體積組成呈線性關(guān)系，可按算數(shù)平均值求出。例如溶劑A和

19、B混合物的極性參數(shù)PAB可按下式求出: 對極性吸附和正相色譜: 對于反相色譜: ABAABBPPP,12()22110PPkk ,21()22110PPkk20.4.1.液固吸附色譜固定相液固吸附色譜固定相 吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強(qiáng)弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點(diǎn)較多，如線性容量較高，機(jī)械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等，因此，以硅膠用得最多。 在高效液相色譜法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，它們具有填料均勻、粒度小?？籽\的優(yōu)點(diǎn)，能極大地提高柱效。但表面多孔型由于試樣容量較小，目前最廣泛使用的還是全多孔型微粒填全多孔型微粒填料

20、。料。20.4.1.液固吸附色譜固定相液固吸附色譜固定相 吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強(qiáng)弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點(diǎn)較多，如線性容量較高，機(jī)械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等，因此，以硅膠用得最多。 在高效液相色譜法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，它們具有填料均勻、粒度小?？籽\的優(yōu)點(diǎn)，能極大地提高柱效。但表面多孔型由于試樣容量較小，目前最廣泛使用的還是全多孔型微粒填料。全多孔型微粒填料。 當(dāng)流動相通過固定相（吸附劑）時(shí)，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動相分子。同時(shí)，當(dāng)試樣分子（X）被流動相帶入柱內(nèi)，只要它們在固定相有一定程度的保

21、留就要取代數(shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃降牧鲃酉嗳軇┓钟茫┯谑牵诠潭ㄏ啾砻姘l(fā)生競爭吸附: Xs + nMmXm +nMs吸 附解 吸液固色譜一般較少考慮吸附劑類型。常采用薄層色譜技術(shù)進(jìn)行初步探索。吸附劑含水量是控制吸附劑活性，影響溶質(zhì)保留的重要因素。 研究最多、應(yīng)用最廣泛的高效液相色譜類型。 可分為液-液色譜和化學(xué)鍵合相色譜。前者是早期主要分配色譜類型，以物理吸附涂漬固定液在多孔載體表面上為固定相；后者以鍵合相為固定相，即化學(xué)鍵合固定相至載體或基質(zhì)表面。 化學(xué)鍵合相色譜巳成為占絕對優(yōu)勢的分配色譜類型。 液液色譜固定相是將極性或非極性固定液涂漬在全多孔或薄殼型硅膠等載體表面形成的液 膜 。 要 求 載 體

22、 表 面 惰 性 ， 比 表 面 積 約50250m2/g，比表面積不宜太高，以降低殘余吸附效應(yīng)。 固定液涂漬在載體上有兩種方法：一種是靜態(tài)法靜態(tài)法，以固定液溶液浸漬載體，然后用緩慢地蒸發(fā)除去溶劑；另一種是在位動態(tài)涂漬法在位動態(tài)涂漬法，將載體填充在色譜柱中，然在將一定固定液濃度的流動相連續(xù)流經(jīng)色譜柱，至固定液在載體和流動相中達(dá)到分布平衡，形成穩(wěn)定色譜體系。 1.鍵合相色譜固定相鍵合相色譜固定相 鍵合固定相的性能指標(biāo)有:(1).鍵合量:可以鍵合硅膠含碳量和表面覆蓋率表示，其含碳范圍5%40%，表面覆蓋率1-4mol/m2。(2).按某指定k值溶質(zhì)測定的理論塔板數(shù)。(3).色譜柱滲透性，可以柱前壓

23、度量。(4).兩種不同溶質(zhì)的分離選擇性。(5).保留值k的重現(xiàn)性。(6).色譜峰的對稱性。(7).穩(wěn)定性:耐溶劑和pH范圍。 根據(jù)色譜體系固定相和流動相相對極性，可分為反相和正相鍵合相色譜反相和正相鍵合相色譜。 20.5.2.1.化學(xué)鍵合、化學(xué)吸附色譜固定相化學(xué)鍵合、化學(xué)吸附色譜固定相OHSiSiRX+SiSiORCH3CHCHCH3332.化學(xué)吸附改性色譜固定相化學(xué)吸附改性色譜固定相 其典型代表是新近以微粒氧化鋯、氧化鋯/氧化鎂等為基質(zhì)，通過路易斯酸堿化學(xué)吸附作用，制備長鏈烷基膦酸(C8-C18)及含極性基團(tuán)衍生物的非極性和極性色譜固定相。 它們具有耐溶劑、耐酸堿(pH1-12)、化學(xué)穩(wěn)定和

24、適用范圍廣的特點(diǎn)，其色譜性能與鍵合硅膠固定相基本類似，而制備簡便、適用堿性化合物、蛋白質(zhì)等生物樣品分離，是一類極具發(fā)展?jié)摿Φ男滦虷PLC固定相。 反相鍵合相色譜的分離機(jī)理，可用所謂疏溶劑作用理論來解釋。 這種理論把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有較強(qiáng)的流水特性。 當(dāng)用極性溶劑為流動相來分離含有極性官能團(tuán)的有機(jī)化合物時(shí)，一方面，分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動相的作用，促使它離開固定相，并減小其保留作用。顯然，兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。固定相

25、選擇 改變非極性鍵合相烴基鏈長和鍵合量，鏈長增加導(dǎo)致溶質(zhì)保留值k升高，但長鏈之間k和差別較小，相同表面覆蓋率C18柱保留略大于C8柱。2. 流動相選擇 改變流動相溶劑性質(zhì)和組成，這是調(diào)節(jié)k和選擇性最簡便、有效的方法。 3.流動相pH值 流動相緩沖溶液pH值對離子性溶質(zhì)保留有顯著影響，pH值變化可導(dǎo)致k值10倍左右變化，視溶質(zhì)離子化基團(tuán)多少而異。 4. 衍生化技術(shù) 與氣相色譜類似，HPLC也采用衍生化技術(shù)，特別是反相色譜，通過樣品組分柱前衍生化可達(dá)到兩個(gè)目的:一是降低溶質(zhì)極性，提高疏水性;二是向溶質(zhì)中引進(jìn)檢測響應(yīng)，主要是紫外吸收、熒光激發(fā)基團(tuán)，以提高檢測靈敏度或高選擇性檢測響應(yīng)。溶質(zhì)柱后衍生化則

26、只有利于提高檢測靈敏度。相對分子質(zhì)量10000的脂溶性樣品一般采用反相色譜分離。圖20-19. 鄰苯二甲醛柱前衍生化氨基酸RPC分離色譜圖相對分子質(zhì)量10000的脂溶性樣品一般采用反相色譜分離。圖20-20.極性氨基柱反相條件下分離糖類化合物物 在色譜體系中引入一種與樣品溶質(zhì)離子電荷相反的離子對試劑，通常稱為對離子或反離子(counterion)，它與溶質(zhì)離子形成離子對，從而改變?nèi)苜|(zhì)在兩相中的分配，使離子性溶質(zhì)的保留行為和分離選擇性發(fā)生顯著變化。 常用的離子對試劑有提供陰離子的C4 - C8烷基磺酸鹽、烷基硫酸鹽、羧酸鹽、萘磺酸鹽、高氯酸鹽等;提供陽離子的季銨鹽和烴基胺，如四丁基銨鹽、十六烷基

27、三甲基銨鹽、三乙胺等。 將離子對試劑涂漬在液液色譜的硅膠載體上或溶于流動相中，可構(gòu)成液液離子對分配色譜，由于固定相的流失，這類離子對色譜應(yīng)用不多。 在反相色譜中，離子對試劑加入緩沖液和甲醇、乙腈等極性有機(jī)溶劑的流動相構(gòu)成反相離子對色譜。 保留機(jī)理： SmmYXYXmmsXYYXYXKmXYmsYKXYXKmsmXYmsVVYKVVKk反相離子對色譜分離水溶性維生素 手性高效液相色譜可分為手性固定相(chiral stationary phase，CSP)/非手性流動相和非手性固定相/含手性選擇劑流動相，即手性流動相兩種色譜技術(shù)。具實(shí)用價(jià)值手性流動相添加劑品種較少，這里主要介紹前者。 采用手性固

28、定相CSP的高效液相色譜體系的流動相與一般分配色譜相似，根據(jù)CSP與流動相相對極性不同可構(gòu)成正相或反相色譜，其中采用極性水溶性流動相的反相手性色譜應(yīng)用較多。 1. 給體-受體手性固定相 這是Pirkle研究組最先開發(fā)的一類CSP,由含末端羧基或異氰酸酯芳香烴手性配體與氨基鍵合硅膠縮合，分別形成具手性取代芳香酰胺或脲型結(jié)構(gòu)CSP，亦稱為Pirkle手性固定相。2.多糖類手性固定相 主要是纖維素及其衍生物CSP，以引進(jìn)芳環(huán)的取代苯甲酸酯衍生化纖維素居多，如纖維素三(3,5-二甲苯基氨基甲酸酯)，纖維素三(4-甲基苯甲酸酯)，纖維素三乙酸酯等。3.環(huán)糊精手性鍵合固定相 亦稱為空穴型固定相。環(huán)糊精簡稱

29、CD，具手性空穴結(jié)構(gòu)，CD-CSP可實(shí)施正相和反相兩種色譜體系。 4.蛋白質(zhì)手性固定相 一般通過含氨基、二醇基等鍵合硅膠中間體將蛋白質(zhì)鍵合至硅膠上。這類CSP只能用于反相色譜體系。 以生物活性配體(如酶、抗體、激素等)通過間隔臂鍵合到多孔微粒固體基質(zhì)為固定相，不同pH值的緩沖溶液為流動相，依據(jù)生物分子(氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、核酸等)與固定相配體間的特異、可逆的相互親和作用力差異，即形成可離解的配位復(fù)合物，亦稱為鎖-鍵結(jié)構(gòu)復(fù)合物或絡(luò)合物(lock-and-key structural complex)，實(shí)現(xiàn)生物活性分子分離和純化。 固定相由基質(zhì)、間隔臂、和配體三部分組成。 1. 基質(zhì)材料有天然和合

30、成聚合物等有機(jī)基質(zhì)。 2. 間隔臂通常為不同鏈長的雙功能基化合物。 3. 固定相配體主要是:(1).染料;(2).具包結(jié)絡(luò)合作用的大環(huán)化合物;(3).生物特效配體;(4). 與生物活性分子發(fā)生作用的藥物， 此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來測定溶液中陽離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。 離子交換色譜法是利用不同待測離子對固定相親和力的差別來實(shí)現(xiàn)分離的。其固定相采用離子交換樹脂，樹脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平

31、衡離子。當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下：陽離子交換： 陰離子交換： Xm+ Y Rs+_Y+mX+Rs+_X_mYR+s_+Y_m+X_R+s 這里，XRs 、YRs和Xm、Ym分別代表X、Y在固定相上和流動相中濃度。色譜過程分布平衡常數(shù)為溶質(zhì)X在固定相和流動相濃度之比，上式重排得:msmsEXXYRYXRKmSEXmSYYRKXXRK 設(shè)色譜柱內(nèi)離子交換劑的質(zhì)量是WS，則固定相上溶質(zhì)的量(mol或g)為XRSWS;柱內(nèi)流動相體積Vm,溶質(zhì)量為XmVm。溶質(zhì)色譜保留值k為: 對于典型的磺酸型陽離子交換樹脂，一價(jià)離子的KB/A值按以下順序：

32、 Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+二價(jià)離子的順序?yàn)椋?Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+，Zn2+Mg2+對于季鋁型強(qiáng)堿陰離子交換樹指，各陰離子的選擇性順序?yàn)椋篊lO4-I-HS04-SCN-NO2-Br-CN-Cl-BrO3-OH- HCO3-H2P04-IO3-CH3COOFmSmSEXmmSSVWYYRKVXWXRk現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的離子交換固定相主要是三種類型:1. 苯乙烯和二乙烯苯交聯(lián)聚合物離子交換樹脂。2. 表面薄殼型無機(jī)-有機(jī)復(fù)合型交換劑。3. 硅膠化學(xué)鍵合離子交換劑。 離子交換色譜流動相具有其他色譜方法相同的要求，即必須溶解樣品，有合適溶劑強(qiáng)度以獲得合理的保留

33、時(shí)間和k值，和各溶質(zhì)有差異的相互作用以改進(jìn)分離選擇性。離子交換色譜流動相是含離子水溶液，常是緩沖劑溶液。 流動相緩沖液的類型、離子強(qiáng)度、pH值及添加有機(jī)溶劑類型、濃度等是實(shí)現(xiàn)分離條件優(yōu)化的主要因素。 離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來的一種分離方法。離子交換色譜法在無機(jī)離子的分析和應(yīng)用受到限制。例如，對于那些不能采用紫外檢測器的被測離子，如采用電導(dǎo)檢測器，由于被測離子的電導(dǎo)信號被強(qiáng)電解質(zhì)流動相的高背景電導(dǎo)信號掩沒而無法檢測。 為了解決這一問題，1975年Small等人提出一種能同時(shí)測定多種無機(jī)和有機(jī)離子的新技術(shù)。他們在離子交換分離柱后加一根抑制柱，抑制柱中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹脂。

34、通過分離柱后的樣品再經(jīng)過抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)的流動相，從而用電導(dǎo)檢測器可直接檢測各種離子的含量。這種色譜技術(shù)稱為離子色譜。若樣品為陽離子，用無機(jī)酸作流動相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換劑。當(dāng)試樣經(jīng)陽離子交換劑的分離往后，隨流動相進(jìn)入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個(gè)重要反應(yīng)： 由反應(yīng)可見：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動相本底電導(dǎo)的影響。同時(shí)，又將樣品陽離子M+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的26倍，提高了所測陽離子電導(dǎo)的檢測靈敏度。對于陰離子樣品也有相似的作用機(jī)理。 在分離柱后加一個(gè)抑制柱的離子色譜亦稱為抑制型離子色譜或稱雙柱

35、離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過抑制柱后會加寬，降低了分離度。后來，F(xiàn)rits等人提出采用抑制柱的離子色譜體系，而采用了電導(dǎo)率極低的溶液，例如110-4510-4moldm-3苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動相，稱為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。 離子排阻色譜(Ion-exclusion Chromatography)分離測定的是低電離度的分子而不是離子，分離在離子交換柱上實(shí)現(xiàn)。 理論基礎(chǔ)是說明離子通過膜擴(kuò)散的道南(Donnan)平衡，其主要論點(diǎn)是離子交換劑上大體積不擴(kuò)散離子可排斥同電荷小離子擴(kuò)散進(jìn)入該相。由于陽離子和陰離子交換劑排阻離子，使快速通過色譜柱，無保留或保留值很

36、小;而非離子性溶質(zhì)被分布、保留并實(shí)現(xiàn)分離。 體 積 排 阻 或 排 除 色 譜 ( S i z e - E x c l u s i o n Chromatography,SEC),亦稱為凝膠色譜或凝膠過濾色譜,是分析高分子化合物的色譜技術(shù)。SEC填料為微粒均勻網(wǎng)狀多孔凝膠材料。 比填料平均孔徑大的分子被排阻在孔外而無保留，被最先洗出;分子體積比孔徑小的分子完全滲透進(jìn)入孔穴，最后洗出; 處于這兩者之間具中等大小體積分子滲透進(jìn)入孔穴，由于滲透能力差異而顯示保留不同，產(chǎn)生分子分級，這取決于分子體積，在一定程度上亦與分子形狀有關(guān)。 因此，SEC分離是基于溶質(zhì)分子體積差異在凝膠固定相孔穴內(nèi)的排阻和滲透性

37、大小。 K為溶質(zhì)的分配系數(shù)。Vg凝膠基質(zhì)骨架體積， VS孔穴中溶劑體積， Vo凝膠顆粒間體積。 K值范圍從完全排除的大體積分子K為0(Ve=V0)到完全滲透的小分子溶劑K為1(Ve-V0=VS)之間。MSSOeCCVVVK SEC經(jīng)常使用的固定相有兩種，即粒徑510m均勻網(wǎng)狀孔穴的交聯(lián)聚含物和無機(jī)材料，如多孔玻璃、硅膠基質(zhì)等。 SEC可分為凝膠過濾和凝膠滲透色譜。前者使用親水性填料和水溶性溶劑流動相，如不同pH值的各種緩沖溶液;后者采用疏水性填料和非極性有機(jī)溶劑，最常用的是四氫呋喃，其次是二甲基甲酰胺、鹵代烴等流動相。SEC不采用改變流動相組成來改善分離度，溶劑選擇主要考慮對樣品溶解能力及與固

38、定相、檢測器的匹配。 SEC方法主要應(yīng)用是分離測定合成和天然高分子產(chǎn)物。例如從氨基酸和多肽中分離蛋白質(zhì);測定聚合物的相對分子質(zhì)量和相對分子質(zhì)量分布。這常是其他色譜方法不能解決的課題。聚苯乙烯分子量分布SEC色譜圖 微徑柱(Microbore column)一般指內(nèi)徑12mm細(xì)內(nèi)徑填充柱和內(nèi)徑1mm的毛細(xì)管填充柱、整體柱和開管柱。優(yōu)點(diǎn): 1. 可采用較長色譜柱(2m)，高壓泵輸液1000大氣壓以上，獲得每米數(shù)105106高理論塔板的超高柱效; 高壓能獲得高線速，可實(shí)現(xiàn)快速分離。 2. 較小柱體積，柱填料可比常規(guī)分析柱節(jié)省100600倍。較低體積流速，導(dǎo)致低溶劑消耗，降低成本和減少環(huán)境污染。 3.

39、 分離洗脫較小的峰體積,導(dǎo)致濃度敏感檢測器(紫外、熒光、ESI-MS)有較高的響應(yīng)，大大降低最低檢出限。 4. 石英毛細(xì)管柱內(nèi)壁易于化學(xué)改性，降低溶質(zhì)與管壁作用，提高柱效和選擇性。 微徑柱液相色譜具有高靈敏度、高通量分離能力，適用于多組分復(fù)雜混合物的分離分析。碳黑萃取稠環(huán)芳烴混合物分離色譜圖 制備色譜是分離、收集一種或多種色譜純組分，供進(jìn)一步使用。與分析分離的區(qū)別是色譜柱尺寸、柱容量更大。 評價(jià)制備色譜方法的主要指標(biāo)是: 1. 最大允許分離樣品體積或量(色譜柱負(fù)荷); 2. 單位時(shí)間內(nèi)分離純物質(zhì)的量,即產(chǎn)率; 3. 淋洗溶劑量或樣品在分離中的稀釋度。影響制備色譜產(chǎn)率的主要因素有:1. 產(chǎn)率隨柱長、柱內(nèi)徑、柱效升高而增加，但不呈線性關(guān)系。2. 比較獲得相同產(chǎn)率使用粗(2540m)或細(xì)(10m)不同顆粒填料，操作條件各有優(yōu)缺點(diǎn)。3. 制備分離的目標(biāo)組分要求有比較高的分離選擇性值，可允許較大進(jìn)樣量。4. 制備色譜經(jīng)常在柱超負(fù)荷條件下操作，一般適當(dāng)降低進(jìn)樣濃度，保持在線性分布范圍，用增加進(jìn)樣體積提高進(jìn)樣量以提高產(chǎn)率。5. 以硅膠為填料的正相色譜通常是制備分離首選方法，低沸點(diǎn)有機(jī)溶劑易于回收，具有成本低的優(yōu)點(diǎn)。但對各種特殊分離，如對映體，蛋白質(zhì)等需采用手性、弱疏水性填料。