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1、閩南師范大學(xué)畢業(yè)論文雙水楊醛乙二胺西佛堿鐵配合物與牛血清白蛋白相互作用模式的研究Research the interactation mode between ferrous - BIS salicylidene ethylenediamine and BSA姓 名： 學(xué) 號(hào)： 系 別： 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)系 專 業(yè)： 應(yīng)用化學(xué) 年 級(jí)： 10級(jí) 指導(dǎo)老師： 2014年1月10日I摘要雙水楊醛乙二胺西佛堿和鐵（）-雙水楊醛乙二胺西佛堿配合物（配合物1）的合成，并對(duì)配合物1進(jìn)行紅外表征。用熒光光譜及紫外吸收光譜方法，研究該配合物1與牛白蛋白（BSA）的相互作用。研究表明配合物1對(duì)BSA猝滅作用屬于靜
2、態(tài)猝滅，根據(jù)Stern-Volmer 方程, 計(jì)算了配合物1與BSA 間的結(jié)合常數(shù)Kq，用Van.t Hoff方程計(jì)算了熱力學(xué)參數(shù)；乙醇和EDTA為探針以及透析法推測(cè)了配合物1-BSA復(fù)合物透析過(guò)程中生成新的物質(zhì)。關(guān)鍵詞：雙水楊醛乙二胺西佛堿；亞鐵離子；熒光光譜；牛血清白蛋白；EDTAAbstractThe Synthesis of BIS salicylidene ethylenediamine Schiff base and Fe() - BIS salicylidene ethylenediamine Schiff base .And the structures of Fe() - B
3、IS salicylidene ethylenediamine Schiff base were confirmed by infrared. We reseached the interactation with the complexes and BSA by UV and molecular fluorescence analysis .The study shows that the quenching effect on BSA belongs to static quenching.We calculated the binding constant Kq of the compl
4、exes and BSA according to the Stern - Volmer equation and calculate the thermodynamic parameters with the Van. T Hoff equation.We used Ethanol and EDTA as probe to speculate the new substances from the dialysis process .Key words: BIS salicylidene ethylenediamine Schiff Base; Fe(); fluorescence spec
5、trum;BSA;EDTA目 錄中文摘要I英文摘要I前言11 實(shí)驗(yàn)部分11.1儀器與試劑11.2 亞鐵雙水楊醛乙二胺西佛堿配合物（配合物1）的合成11.3 配合物1與牛血清白蛋白(BSA)相互作用熒光測(cè)定21.3.1 配合物1與BSA相互作用常溫?zé)晒鉁y(cè)定21.3.2配合物1與BSA相互作用變溫?zé)晒鉁y(cè)定21.3.3配合物1與BSA相互作用同步熒光測(cè)定21.4 配合物1與BSA相互作用紫外測(cè)定21.5 EDTA對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的相互作用的影響測(cè)定21.5.1 EDTA對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的作用紫外測(cè)定21.5.2 雙水楊醛乙二胺西佛堿與BSA相互作用的熒光測(cè)定31.5.3 EDTA對(duì)配
6、合物1-BSA復(fù)合物的作用熒光測(cè)定31.5.4 Fe(edta)配合物對(duì)雙水楊醛乙二胺西佛堿-BSA復(fù)合物的作用熒光測(cè)定31.6 乙醇對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的作用熒光測(cè)定31.7 采用透析法對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的相互作用結(jié)果的測(cè)定32結(jié)果與討論42.1亞鐵雙水楊醛乙二胺西佛堿配合物紅外光譜表征42.2 配合物1與BSA相互作用的熒光分析42.2.1 配合物1與BSA相互作用常溫?zé)晒夥治?2.2.2配合物1與BSA相互作用熒光猝滅方式分析52.2.3用靜態(tài)猝滅法對(duì)配合物1與BSA的相互作用進(jìn)行分析62.2.4配合物1與BSA之間的作用力類型分析82.2.5配合物1與BSA相互作用同步熒光分
7、析82.3 配合物1與BSA相互作用紫外表征92.4 EDTA對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的相互作用的影響的分析102.4.1 EDTA對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的相互作用的影響的熒光分析102.4.2 EDTA對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的相互作用的影響的紫外分析102.5 乙醇對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的相互作用的影響的熒光分析122.6 配合物1與BSA相互作用模式圖122.7 采用透析法對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的相互作用結(jié)果的分析132.7.1配合物1與BSA作用透析后產(chǎn)物紅外光譜表征132.7.2透析法對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的相互作用結(jié)果的分析143結(jié)論15參考文獻(xiàn)16致謝18前言 蛋白質(zhì)是生
8、物體的重要組成部分，是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。血清白蛋白常作為一種模型蛋白質(zhì)用于生物醫(yī)用材料研究領(lǐng)域1 , 2 ，可與許多內(nèi)源及外源性化合物結(jié)合起到存儲(chǔ)與轉(zhuǎn)運(yùn)作用3 , 4 ，即在體內(nèi)起著酸度保持、金屬離子、氨基酸、脂肪酸、藥物等的貯存、運(yùn)載等重要的作用5，是基礎(chǔ)科學(xué)研究中最常用的藥物靶蛋白之一 6 。從不同角度研究以白蛋白為代表的蛋白質(zhì)與具有生物活性小分子之間的相互作用，已成為一個(gè)非?；钴S的研究課題7。牛血清白蛋白( BSA) 肽鏈含有582個(gè)氨基酸殘基，在ex = 280 nm 時(shí)，BSA 的內(nèi)源熒光主要來(lái)源于19個(gè)酪氨酸和2個(gè)色氨酸殘基。酪氨酸的熒光主要通過(guò)能量轉(zhuǎn)移給色氨酸而發(fā)出，2個(gè)色氨酸
9、分別位于134位和212位，其發(fā)射峰特征、能量轉(zhuǎn)移及熒光壽命等指標(biāo)可以對(duì)蛋白質(zhì)分子中熒光生色基團(tuán)的結(jié)構(gòu)及其所處的微環(huán)境提供有效的信息8, 9。本文利用熒光光譜法和紫外吸收光譜法研究了鐵（）雙水楊醛乙二胺西佛堿配合物（配合物1）與牛血清白蛋白（BSA）相互作用的機(jī)理；利用透析法以及乙醇、EDTA為探針推測(cè)配合物與BSA相互作用模式。1 實(shí)驗(yàn)部分1.1 儀器和試劑試劑：牛白蛋白(BSA) （生化試劑） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司水楊醛 （AR） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司乙二胺 （AR） 廣東汕頭市西隴化工廠六水合硫酸亞鐵銨 （AR） 廣東汕頭市西隴化工廠EDTA （AR） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司乙
10、醇 （AR） 西隴化工股份有限公司儀器： LS-55 熒光分光光度計(jì) （美國(guó)PE 公司） UV-2550紫外分光光度計(jì) （Shimadzu公司）1.2 亞鐵-雙水楊醛乙二胺西佛堿配合物（1）的合成取乙二胺5.6mL和17mL水楊醛溶解于50mL甲醇中，在冷水浴中攪拌30min，靜置15min，減壓抽濾，用乙醇洗滌，在常溫下干燥6h，得亮黃色固體粉末，再取2.5g固體用40mL乙醇重結(jié)晶、抽濾，在常溫下干燥4h，得黃色晶體即為雙水楊醛乙二胺西佛堿。取雙水楊醛乙二胺西佛堿1.000g溶解于40mL甲醇中，再加入硫酸亞鐵銨1.000g，回流1h，冷卻，過(guò)濾，干燥，得淡粉色固體即為Fe（）雙水楊醛乙二
11、胺西佛堿配合物（配合物1）。1.3 配合物1與BSA相互作用熒光測(cè)定1.3.1 配合物1與BSA相互作用常溫?zé)晒鉁y(cè)定稱取0.048g 配合物1溶解并定容于100mL容量瓶中，用HAc-NaAc緩沖溶液（pH=6.8）配制溶度為110-4mol/L的BSA溶液，然后于一系列10.00mL的容量瓶中加入1.00mL的BSA溶液，并加入不同體積的配合物1溶液，定容。以=292nm為激發(fā)波長(zhǎng)，記錄300450nm范圍的熒光光譜。1.3.2 配合物1與BSA相互作用變溫?zé)晒鉁y(cè)定稱取0.048g配合物1溶解并定容于100mL容量瓶中，用HAc-NaAc緩沖溶液（pH=6.8）配制溶度為110-4mol/L
12、的BSA溶液，然后于一系列10.00mL的容量瓶中加入1.00mL的BSA溶液，并加入不同體積的配合物1溶液，定容。將該系列溶液分別于25,30,35和40下，以=290nm為激發(fā)波長(zhǎng)，記錄300450nm范圍內(nèi)的熒光光譜。1.3.3 配合物1與BSA相互作用同步熒光測(cè)定稱取0.049g配合物1溶解并定容于100mL容量瓶中，用HAc-NaAc緩沖溶液（pH=7.0）配制溶度為110-4mol/L的BSA溶液，然后于一系列10.00mL的容量瓶中加入1.00mL的BSA溶液，并加入不同體積的配合物1溶液，定容。以=292nm為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)定=15nm和=60nm時(shí)的同步熒光光譜。1.4 配合物
13、1與BSA相互作用紫外測(cè)定稱取0.024g配合物1溶解并定容于100mL容量瓶中，用HAc-NaAc緩沖溶液（pH=6.9）配制溶度為110-4mol/L的BSA溶液，然后于一系列10.00mL的容量瓶中加入1.00mL的配合物1溶液，并加入不同體積的BSA溶液，定容。以配合物1溶液為參比液，記錄200500nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。1.5 EDTA對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的相互作用的影響測(cè)定1.5.1 EDTA對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的作用紫外測(cè)定稱取0.048g配合物1溶解并定容于100mL容量瓶中，稱取0.039gEDTA用HAc-NaAc緩沖溶液（pH=6.8）溶解并定容于100mL容
14、量瓶中，用HAc-NaAc緩沖溶液（pH=6.8）配制溶度為110-4mol/L的BSA溶液，然后于一系列10.00mL的容量瓶中加入1.00mL的BSA溶液和3.00mL配合物1溶液，再加入不同體積的EDTA溶液，定容。以配合物1與BSA混合液為參比液，記錄200500nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。1.5.2 雙水楊醛乙二胺西佛堿與BSA作用的熒光測(cè)定稱取0.032g雙水楊醛乙二胺西佛堿溶解并定容于100mL容量瓶中，用HAc-NaAc緩沖溶液（pH=6.8）配制溶度為110-4mol/L的BSA溶液，然后于一系列10.00mL的容量瓶中加入1.00mL的BSA溶液，并加入不同體積的雙水楊醛乙二
15、胺西佛堿溶液，定容。以=280nm為激發(fā)波長(zhǎng)，記錄300450nm范圍的熒光光譜。1.5.3 EDTA對(duì)配合物1- BSA復(fù)合物的相互作用的影響熒光測(cè)定稱取0.048g配合物1溶解并定容于100mL容量瓶中，稱取0.039gEDTA用HAc-NaAc緩沖溶液（pH=6.8）溶解并定容于100mL容量瓶中，用HAc-NaAc緩沖溶液（pH=6.8）配制溶度為110-4mol/L的BSA溶液，然后于一系列10.00mL的容量瓶中加入1.00mL的BSA溶液和3.00mL配合物1溶液，再加入不同體積的EDTA溶液，定容。以=280nm為激發(fā)波長(zhǎng)，記錄300450nm范圍的熒光光譜。1.5.4 Fe(
16、edta)配合物對(duì)雙水楊醛乙二胺西佛堿- BSA復(fù)合物的作用熒光測(cè)定稱取0.032g雙水楊醛乙二胺西佛堿溶解并定容于100mL容量瓶中，稱取0.016g六水合硫酸亞鐵銨和0.030gEDTA配制摩爾比為2:1的Fe(edta)配合物溶液，用HAc-NaAc緩沖溶液（pH=6.8）配制溶度為110-4mol/L的BSA溶液，然后于一系列10.00mL的容量瓶中加入1.00mL的BSA溶液和5.00mL雙水楊醛乙二胺西佛堿溶液，再加入不同體積的Fe(edta)配合物溶液，定容。以=280nm為激發(fā)波長(zhǎng)，記錄300450nm范圍的熒光光譜。1.6 乙醇對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的作用熒光測(cè)定稱取0.0
17、49g配合物1溶解并定容于100mL容量瓶中，用HAc-NaAc緩沖溶液（pH=6.8）配制溶度為110-4mol/L的BSA溶液，然后于一系列10.00mL的容量瓶中加入1.00mL的BSA溶液和3.00mL配合物1溶液，再加入不同體積的乙醇溶液，定容。以=280nm為激發(fā)波長(zhǎng)，記錄300450nm范圍的熒光光譜。1.7 采用透析法對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的相互作用影響的測(cè)定稱取0.050g配合物1和0.10gBSA，加入30mL蒸餾水溶解。用透析袋透析且每隔2天換一次水，每次換水前取1mL透析袋內(nèi)的原液并稀釋25倍，以蒸餾水為參比，記錄200500nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。2 結(jié)果與討論2
18、.1亞鐵雙水楊醛乙二胺西佛堿配合物紅外光譜表征利用NicoLet360光譜儀對(duì)亞鐵雙水楊醛乙二胺西佛堿配合物（配合物1）進(jìn)行紅外光譜表征，結(jié)果如圖1所示。圖1 雙水楊醛乙二胺西佛堿及配合物1紅外光譜圖a：雙水楊醛乙二胺西佛堿；b：配合物1如圖1所示，雙水楊醛乙二胺西佛堿（曲線a）及其配合物1（曲線b）。對(duì)比曲線a和曲線b，C-C振動(dòng)由1498cm-1和1610 cm-1移動(dòng)至1491 cm-1和1608 cm-1，變化不明顯，說(shuō)明水楊醛的基本骨架未變；C-N伸縮振動(dòng)由原來(lái)的1635 cm-1移動(dòng)至1608 cm-1，向低波數(shù)移動(dòng)了27 cm-1，說(shuō)明N原子上的孤對(duì)電子可能與Fe()發(fā)生配位作用
19、；O-H在25003200cm-1出現(xiàn)寬而散的特征峰移動(dòng)至3350cm-1左右，向高波數(shù)移動(dòng)，說(shuō)明O原子被Fe()離子競(jìng)爭(zhēng)走孤對(duì)電子。由此說(shuō)明，F(xiàn)e()與雙水楊醛乙二胺西佛堿作用生成新的配合物。2.2 配合物1與BSA相互作用的熒光表征 2.2.1 配合物1與BSA相互作用常溫?zé)晒夥治龉潭˙SA的濃度為110-4mol/L，改變配合物1的濃度，并以ex292 nm的激發(fā)波長(zhǎng)分別激發(fā)BSA溶液及BSA與配合物1的混合溶液。然后分別記錄波長(zhǎng)為300450nm的熒光發(fā)射光譜，其熒光發(fā)射光譜的測(cè)定結(jié)果如圖2所示。圖2 不同濃度配合物1對(duì)BSA溶液熒光光譜的影響af：C配合物1/(10-4mol/L )
20、0，1.1，3.3，5.5，7.7，9.9當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為292nm時(shí)，配合物1在300450nm范圍內(nèi)無(wú)熒光發(fā)射，而B(niǎo)SA由于其本身的色氨酸殘基和絡(luò)氨酸殘基而產(chǎn)生內(nèi)源熒光10。因此，固定BSA的濃度不變，依次加入不同濃度配合物1，隨著配合物濃度的逐漸增加，BSA在350nm附近的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度有規(guī)律的減弱，其結(jié)果如圖2所示，該特征的出現(xiàn)初步表明配合物1與BSA發(fā)生了一定程度的作用。2.2.2 配合物1與BSA相互作用熒光猝滅方式分析熒光猝滅是猝滅劑與熒光體激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用的結(jié)果，猝滅過(guò)程通常有動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅之分，它們均遵從Stern-Volmer方程：F0/F=1+kq0CQ=1+ ks
21、v CQ式中，F(xiàn)0和F分別為未加入猝滅劑時(shí)BSA的相對(duì)熒光強(qiáng)度；kq為雙分子猝滅過(guò)程的速率常數(shù)；0為無(wú)猝滅劑存在時(shí)熒光分子的平均壽命，通常取值10-8s11；ksv 為Stern-Volmer猝滅常數(shù)，是雙分子猝滅速率常數(shù)與單分子衰變速率常數(shù)的比率；CQ為猝滅劑的摩爾濃度12, 13。而區(qū)分動(dòng)態(tài)猝滅與靜態(tài)猝滅的主要依據(jù)之一是：動(dòng)態(tài)猝滅主要依賴于分子的擴(kuò)散，增加溫度導(dǎo)致擴(kuò)散速度加快，猝滅常數(shù)將隨著溫度的升高而增大；而靜態(tài)催滅，溫度升高，將導(dǎo)致配合物的穩(wěn)定性降低，靜態(tài)猝滅常數(shù)的值將隨著溫度的升高而減小。因此，根據(jù)Stern-Volmer方程，取BSA與配合物1的混合體系在不同溫度時(shí)熒光發(fā)射光譜的3
22、50nm處的相對(duì)熒光強(qiáng)度為F，以（F0/F-1）與所加入的配合物1濃度c0作圖，得到牛血清蛋白的Stern-Volmer猝滅曲線，其結(jié)果如圖3所示；由Stern-Volmer方程求的猝滅速率常數(shù)如表1所示。圖3 配合物1-BSA在不同溫度時(shí)Stern-Volmer曲線表1 配合物1-BSA在不同溫度的Stern-Volmer常數(shù)T/KKsv/(Lmol-1)Kq/( Lmol-1s-1)R22982.321042.3210120.9963032.301042.3010120.9973082.231042.2310120.9983132.131042.1310120.995由圖3可以看出，在不同
23、溫度時(shí)，配合物1-BSA體系的Stern-Volmer曲線基本上都具有較好的線性關(guān)系；而且隨著溫度的升高，Stern-Volmer常數(shù)逐漸減小，該現(xiàn)象說(shuō)明配合物1對(duì)BSA的熒光猝滅過(guò)程為靜態(tài)猝滅。另外，由于各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)為2.01010 Lmol-1s-1 14，而配合物1對(duì)BSA的熒光猝滅常數(shù)Kq約為2.241012 Lmol-1s-1，遠(yuǎn)大于雙分子間最大動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，該結(jié)果也進(jìn)一步說(shuō)明配合物1對(duì)牛血清蛋白的猝滅過(guò)程為靜態(tài)猝滅。2.2.3 用靜態(tài)猝滅法對(duì)配合物1與BSA的相互作用進(jìn)行分析在靜態(tài)猝滅過(guò)程中，熒光物質(zhì)與猝滅劑分子間的結(jié)合常數(shù)可根據(jù)熒光強(qiáng)度與猝滅劑濃度的關(guān)
24、系求出。設(shè)蛋白質(zhì)大分子有n個(gè)相同并且相互獨(dú)立的結(jié)合位置，則有：lg(F0/F-1)=lgK+nlgcQ其中F0為未加入猝滅劑時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度；F為加入猝滅劑后BSA的熒光強(qiáng)度；K為熒光體-猝滅劑的結(jié)合常數(shù)，c0為配合物的濃度15。在不同溫度下，將BSA與配合物1的混合體系的熒光發(fā)射光譜曲線的350nm處的F0及F代入上式，得到lg(F0/F-1)與lgc0的關(guān)系圖（如圖4），即求出在不同溫度下的配合物1與BSA得結(jié)合常數(shù)K，相關(guān)系數(shù)R2以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，如表2。圖4 lg(F0/F-1)與lgc的關(guān)系曲線表2 配合物1與BSA的結(jié)合常數(shù)k，R2及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)nT/K 方程k/( Lmol-1)
25、R2n298 lg(F0/F-1)=5.82+1.34x6.611050.9991.34303 lg(F0/F-1)=5.68+1.31x4.791050.9991.31308 lg(F0/F-1)=5.24+1.21x1.741050.9991.21313 lg(F0/F-1)=5.19+1.20x1.551050.9981.20如表2所示，配合物1與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)K和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n（平均值為1.26）均隨著溫度的升高而逐漸降低，該結(jié)果表明一個(gè)配合物1分子與BSA分子中的一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行相互作用，它們之間的結(jié)合常數(shù)K的平均值為3.67105 Lmol-1。而結(jié)合常數(shù)K的大小反映了配合物與
26、BSA相互作用的難易程度，初步分析表明：當(dāng)配合物1與BSA相互作用時(shí)，該配合物的空間構(gòu)位或位阻對(duì)結(jié)合常數(shù)的大小有一定程度的影響。2.2.4 配合物1與BSA之間的作用力類型分析有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)等大分子之間主要是通過(guò)分子間的氫鍵，范德華力，靜電引力等分子間作用力進(jìn)行相互作用，這些分子間的作用力在發(fā)生相互作用時(shí)，反應(yīng)前后體系的熱力學(xué)參數(shù)會(huì)發(fā)生一定程度的變化。因此，可以通過(guò)測(cè)定體系的熱力學(xué)參數(shù)的變化來(lái)判斷小分子與蛋白質(zhì)分子鏈之間的主要作用力的類型16。表3的H，S以及G的計(jì)算值是分別通過(guò)以下3個(gè)方程計(jì)算所得（其中由于溫度變化不大，體系的焓變看成一個(gè)常數(shù)）。lnk=-rH m / (RT)+CG=-
27、RTlnkG=H-TSRoss16與Mohammed17等根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果總結(jié)出判斷生物大分子與小分子結(jié)合性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律，即：S0可能是疏水和靜電作用力；S0可能為氫鍵和范德華力；H0，S0為典型的疏水作用力；H0或者較小，S0為靜電作用力；H0，S0為氫鍵和范德華力。表3 配合物1與BSA相互作用時(shí)的熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算T/KK/( Lmol-1)H/(kJmol-1)S/(JK-1)G/(kJmol-1)2986.61105-83.28-168.04-33.203034.79105-83.28-166.10-32.953081.74105-83.28-170.07-30.903131.55
28、105-83.28-166.71-31.10從表3數(shù)據(jù)中可以看出：配合物1與BSA間相互作用時(shí)，體系的H0，S0，該結(jié)果表明配合物1與BSA間相互作用時(shí)的主要作用力是氫鍵和范德華力。2.2.5 配合物1與BSA相互作用同步熒光分析固定激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的間距，同步掃描激發(fā)和發(fā)射單色器可得同步熒光光譜，這種光譜已被用于蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的分析18-20。而蛋白質(zhì)的熒光主要來(lái)于色氨酸、絡(luò)氨酸，所以一般通過(guò)對(duì)色氨酸或者絡(luò)氨酸的同步熒光的測(cè)定，探討色氨酸或絡(luò)氨酸的構(gòu)象或周圍環(huán)境是否發(fā)生變化21。圖3分別為=15nm與=60nm時(shí)，配合物1與BSA相互作用時(shí)的同步熒光的測(cè)定結(jié)果。圖5 配合物1與BSA相互作
29、用時(shí)的同步熒光光譜A：=15nm；B：=60nmaf：C配合物1/(10-4mol/L )：0，1.1，3.3，5.5，7.7，9.9保持BSA的濃度為110-4mol/L不變，逐漸增加配合物1的濃度，隨著配合物濃度的增加，體系在292nm附近的同步熒光光譜強(qiáng)度均逐漸降低；在=60nm的同步光譜中其最大發(fā)射波長(zhǎng)有一定的紅移，在=15nm的同步熒光光譜中，其最大發(fā)射波長(zhǎng)沒(méi)有明顯變化。該結(jié)果表明配合物1與BSA相互作用時(shí)，主要通過(guò)改變牛血清蛋白中的絡(luò)氨酸殘基的構(gòu)象或周圍環(huán)境，而對(duì)色氨酸殘基的構(gòu)象或其周圍環(huán)境沒(méi)有明顯的影響。2.3 配合物1與BSA相互作用紫外表征固定配合物1的濃度為5.710-4m
30、ol/L，改變BSA的濃度，并以配合物1為參比液，測(cè)定配合物1與BSA的混合溶液。然后分別記錄波長(zhǎng)為240400nm的紫外吸收光譜，其紫外吸收光譜的測(cè)定結(jié)果如圖6所示。圖6 不同濃度BSA對(duì)配合物1溶液紫外光譜的影響ae：C BSA/( 10-5 mol/L )1.0，2.0，3.0，4.0，5.0配合物1在250320nm范圍內(nèi)基本不發(fā)生紫外吸收。由圖6可見(jiàn)，BSA在280nm處有一強(qiáng)吸收峰，是其肽鏈上的色氨酸和絡(luò)氨酸的苯雜環(huán)-*躍遷引起的6。隨著B(niǎo)SA濃度增大，在280nm的吸收峰逐漸增強(qiáng)，且峰位由280nm藍(lán)移到278nm，說(shuō)明配合物1與BSA發(fā)生作用。2.4 EDTA對(duì)配合物1-BSA
31、復(fù)合物的相互作用的影響分析2.4.1 EDTA對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的相互作用的影響紫外分析配合物1-BSA復(fù)合物加入EDTA后紫外吸收光譜如圖7所示。圖7 不同濃度EDTA對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的相互作用的影響紫外光譜圖 ae:CEDTA/( 10-5mol/L) 1.4，4.2，5.6，8.4，42.0EDTA在波長(zhǎng)為200300nm基本不發(fā)生紫外吸收。圖7可見(jiàn)在260nm左右有強(qiáng)吸收峰且峰發(fā)生藍(lán)移現(xiàn)象，表明EDTA對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的相互作用有影響。2.4.2 EDTA對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的相互作用的影響熒光分析有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)等生物大分子之間主要通過(guò)分子間的氫鍵，范德華
32、力，靜電引力等分子間作用力進(jìn)行相互作用。由2.2.4可知，配合物1與BSA之間是通過(guò)分子間氫鍵和范德華力進(jìn)行相互作用，當(dāng)加入其他的物質(zhì)時(shí)會(huì)與BSA或配合物1相互作用，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度發(fā)生變化。如圖810分別為雙水楊醛乙二胺西佛堿與BSA作用熒光光譜圖，F(xiàn)e(edta)配合物對(duì)雙水楊醛乙二胺西佛堿-BSA影響熒光光譜圖和EDTA對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的相互影響的熒光光譜圖。圖8 雙水楊醛乙二胺西佛堿與BSA作用熒光光譜圖圖9 Fe(edta)配合物對(duì)雙水楊醛乙二胺西佛堿-BSA影響熒光光譜圖圖10 EDTA對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的相互影響的熒光光譜圖當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為280nm時(shí)，雙水楊醛乙二胺西
33、佛堿，配合物1與EDTA在300450nm基本不發(fā)生熒光發(fā)射。由Stern-Volmer方程可得，圖8和9猝滅常數(shù)分別為1.181011Lmol-1s-1，3.301011Lmol-1s-1。由2.2.1可知，配合物1對(duì)BSA的猝滅常數(shù)為2.371011 Lmol-1s-1。由此得：雙水楊醛乙二胺西佛堿對(duì)BSA猝滅常數(shù)與Fe(edta)配合物對(duì)雙水楊醛乙二胺西佛堿-BSA猝滅常數(shù)合為4.4810112.371011 Lmol-1s-1，因此可知EDTA對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物起到進(jìn)一步的猝滅作用，所以隨著加入EDTA溶度的增大熒光強(qiáng)度逐漸減弱，如圖10所示。2.5 乙醇對(duì)配合物1與牛血清蛋白體
34、系作用熒光分析固定牛血清蛋白的濃度為110-4mol/L和配合物1的濃度3.610-4mol/L，改變乙醇的濃度，并以=280nm的激發(fā)波長(zhǎng)分別激發(fā)BSA-配合物1溶液及BSA-配合物1與EDTA的混合溶液。然后分別記錄波長(zhǎng)為300450nm的熒光發(fā)射光譜，其熒光發(fā)射光譜的測(cè)定結(jié)果如圖11所示。圖11 不同濃度乙醇對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的影響熒光光譜圖當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為280nm時(shí)，乙醇在300450nm范圍內(nèi)無(wú)熒光發(fā)射，而B(niǎo)SA由于其本身的色氨酸殘基和絡(luò)氨酸殘基而產(chǎn)生內(nèi)源熒光10。因此，固定BSA的濃度不變，依次加入不同濃度乙醇，隨著溶劑極性的降低，BSA在350nm附近有強(qiáng)的熒光發(fā)射峰但是規(guī)律
35、不明顯，其結(jié)果如圖11所示。該特征表明溶劑的極性對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的相互作用基本沒(méi)有影響。2.6 配合物1與BSA相互作用模式圖圖12 配合物1與BSA相互作用模式圖2.7 采用透析法對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的相互作用結(jié)果的分析 2.7.1 配合物1與蛋白質(zhì)作用透析后產(chǎn)物紅外光譜表征利用NicoLet360光譜儀對(duì)配合物1及配合物1-BSA透析產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜表征，結(jié)果如圖12所示。圖13 配合物1及配合物1-BSA透析產(chǎn)物紅外光譜圖a：配合物1；b：配合物1-BSA透析后析出的產(chǎn)物圖14 牛血清白蛋白紅外光譜圖如圖13、14所示，配合物1（曲線a）、配合物1-BSA透析產(chǎn)物（曲線b）和
36、牛血清白蛋白曲線。由曲線a和牛血清白蛋白與曲線b對(duì)比可知，曲線b在755.96cm-1，1245.79cm-1和1608.34cm-1處均沒(méi)有強(qiáng)的吸收峰，兩圖的紅外特征說(shuō)明配合物1-BSA復(fù)合物出先與配合物1和BSA不同的結(jié)構(gòu)，據(jù)此推測(cè)配合物1-BSA經(jīng)透析后可能生成新的物質(zhì)。 2.7.2 透析法對(duì)配合物1-BSA復(fù)合物的相互作用結(jié)果的分析用透析袋透析且每隔2天換一次水，每次換水前取1mL透析袋內(nèi)的原液并稀釋25倍，以蒸餾水為參比，記錄200500nm范圍內(nèi)的紫外吸收光譜，其紫外吸收光譜測(cè)定結(jié)果如圖15所示。圖15 不同時(shí)間配合物1-BSA復(fù)合物透析紫外吸收光譜圖圖15可看出，隨著透析天數(shù)延長(zhǎng)
37、，配合物1-BSA復(fù)合物溶液的紫外吸收逐漸增強(qiáng)，透析至9天后紫外吸收趨于穩(wěn)定。結(jié)合2.7.1紅外光譜圖初步推測(cè)：配合物1-BSA復(fù)合物在透析中紫外吸收不斷增強(qiáng)可能是因?yàn)樯尚碌奈镔|(zhì)。3 結(jié)論本文合成和表征鐵（）-雙水楊醛乙二胺西佛堿配合物，配合物1對(duì)BSA熒光猝滅為靜態(tài)猝滅過(guò)程；它們兩者之間主要通過(guò)范德華力或分子間氫鍵的作用力形式，通過(guò)改變BSA中絡(luò)氨酸殘基的構(gòu)象進(jìn)行相互作用，其結(jié)合常數(shù)的平均值為3.67105 Lmol-1。對(duì)配合物1與BSA相互作用時(shí)作用模式的探討。采用透析法研究表明配合物1-BSA復(fù)合物在透析過(guò)程中可能生成新物質(zhì)。參考文獻(xiàn)1 鄭彩虹, 梁文權(quán), 虞和永.海藻酸-殼聚糖-聚
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畢業(yè)論文雙水楊醛乙二胺西佛堿鐵配合物與牛血清白蛋白相互作用模式的研究
