生物化學(xué)課件：第24章 重組DNA技術(shù)

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1、目目 錄錄 Recombinant DNA Technology第二十四章第二十四章目目 錄錄克隆克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。即無性繁殖。技術(shù)水平：分子克隆技術(shù)水平：分子克隆(molecular clone) 即即DNA 克隆克隆(DNA cloning)細(xì)胞克隆細(xì)胞克隆器官（或組織）克隆器官（或組織）克隆個體克?。▌游锘蛑参铮﹤€體克?。▌游锘蛑参铮┠磕?錄錄重組重組DNA技術(shù)技術(shù)（recombinant DNA technology） 又稱分子

2、克隆（又稱分子克?。╩olecular cloning）或）或DNA克隆克隆（DNA cloning）或基因克?。ǎ┗蚧蚩寺。╣ene cloning) 技術(shù)，技術(shù)，是指在體外利用酶學(xué)方法將目的是指在體外利用酶學(xué)方法將目的DNA片段與能自主片段與能自主復(fù)制的遺傳元件（又叫載體）連接，形成重組復(fù)制的遺傳元件（又叫載體）連接，形成重組DNA分子，進(jìn)而在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴增，從而獲得單一分子，進(jìn)而在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴增，從而獲得單一DNA分子的大量拷貝。分子的大量拷貝。 克隆目的基因后，針對該基因進(jìn)行特定蛋白質(zhì)或克隆目的基因后，針對該基因進(jìn)行特定蛋白質(zhì)或多肽制備以及定向改造基因結(jié)構(gòu)所用的方法及相關(guān)

3、的多肽制備以及定向改造基因結(jié)構(gòu)所用的方法及相關(guān)的工作統(tǒng)稱為基因工程（工作統(tǒng)稱為基因工程（genetic engineering）。因此，）。因此，重組重組DNA技術(shù)又稱為基因工程技術(shù)。技術(shù)又稱為基因工程技術(shù)。 目目 錄錄* 重組重組DNA技術(shù)的發(fā)展簡史技術(shù)的發(fā)展簡史1865年年 G.J.Mendel的豌豆雜交試驗的豌豆雜交試驗1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗1972年年 構(gòu)建第一個重組構(gòu)建第一個重組DNA分子分子(1977年年 美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工，美國南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工， 程公司，專門應(yīng)用重組程公司，專

4、門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物1980年年 開始建造第一家應(yīng)用重組開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠1997年年 英國羅林研究所成功地克隆了英國羅林研究所成功地克隆了“多莉多莉”羊羊Mendel Paul BergIan Wilmut and “Dolly”目目 錄錄第第 一一 節(jié)節(jié)重組重組DNADNA技術(shù)中常用的技術(shù)中常用的工具酶工具酶 Frequently Used Enzymes in Recombinant DNA Technology目目 錄錄限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA連接酶連接酶堿性磷酸酶堿性磷酸酶反轉(zhuǎn)

5、錄酶反轉(zhuǎn)錄酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（末端轉(zhuǎn)移酶）末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（末端轉(zhuǎn)移酶）DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶I大片段大片段 Taq DNA聚合酶聚合酶多核苷酸激酶多核苷酸激酶 工具酶在重組工具酶在重組DNADNA技術(shù)中具有技術(shù)中具有特殊的用途特殊的用途目目 錄錄重組重組DNA技術(shù)中常用的工具酶技術(shù)中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割識別特異序列，切割DNADNA連接酶連接酶催化催化DNA中相鄰的中相鄰的5 磷酸基和磷酸基和3 羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使使DNA切口封合或使兩個切口封合或使兩個DNA分子

6、或片段連接分子或片段連接堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶合成合成cDNA；替代；替代DNA聚合酶聚合酶I進(jìn)行填補，標(biāo)記或進(jìn)行填補，標(biāo)記或DNA序列分析序列分析末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶 在在3 羥基末端進(jìn)行同聚物加尾羥基末端進(jìn)行同聚物加尾DNA聚合酶聚合酶合成雙鏈合成雙鏈cDNA分子或片段連接；缺口平移制作高比活性探針；分子或片段連接；缺口平移制作高比活性探針；DNA序列分析；填補序列分析；填補3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而無外

7、切活性，而無53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，第二鏈合成，雙鏈雙鏈DNA 3 末端標(biāo)記等末端標(biāo)記等Taq DNA聚合酶聚合酶 常用于常用于PCR；產(chǎn)物的；產(chǎn)物的3末端帶有末端帶有A，可用于，可用于T-A克隆克隆多核苷酸激酶多核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針目目 錄錄一、限制性核酸內(nèi)切酶用于切割一、限制性核酸內(nèi)切酶用于切割DNA定義定義:限制性核酸限制性核酸內(nèi)切內(nèi)切酶酶(restriction endonuclease, RE)是識別是識別DNA的特異序列的特異序列, 并在識別位點或其周并在識別位點或其周圍切割

8、雙鏈圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。的一類內(nèi)切酶。限制性核酸內(nèi)切限制性核酸內(nèi)切酶是重組酶是重組DNA技術(shù)中重要的工具酶。技術(shù)中重要的工具酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H目目 錄錄分類：分類：根據(jù)酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾根據(jù)酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性可分為酶活性可分為、型三大類型三大類（基因工程技術(shù)中常用（基因工程技術(shù)中常用型）型）型：屬于復(fù)合功能酶，兼有修飾和切割型：屬于復(fù)合功能酶，兼有修飾和切割DNA兩種特性，需要兩種特性，需要Mg2+、ATPs-腺苷酰甲硫氨酸作為催化的輔因子，在腺苷酰甲硫氨酸作為催化的輔因子，在DNA降解時

9、伴隨有降解時伴隨有ATP的的水解。即它具有核酸內(nèi)切酶、甲基化酶、水解。即它具有核酸內(nèi)切酶、甲基化酶、ATP酶和酶和DNA解旋酶四種活性。解旋酶四種活性。若識別位點上兩條若識別位點上兩條DNA鏈均未甲基化，則行使內(nèi)切酶功能，并在切割鏈均未甲基化，則行使內(nèi)切酶功能，并在切割DNA同時或之后轉(zhuǎn)變?yōu)橥瑫r或之后轉(zhuǎn)變?yōu)锳TP酶；若位點上只有酶；若位點上只有1條鏈被甲基化則發(fā)揮修條鏈被甲基化則發(fā)揮修飾功能，使另一條鏈也甲基化；若位點上兩條鏈均甲基化就與位點解離。飾功能，使另一條鏈也甲基化；若位點上兩條鏈均甲基化就與位點解離。其顯著特點是識別位點和切割部位不一致，無固定切割位點，一般在識其顯著特點是識別位點和

10、切割部位不一致，無固定切割位點，一般在識別位點以外的別位點以外的1kb（不少于（不少于400bp）到幾）到幾kb（可多達(dá)（可多達(dá)7kb）處隨機切割，）處隨機切割，不產(chǎn)生特異片段，故在基因重組中沒有應(yīng)用價值。不產(chǎn)生特異片段，故在基因重組中沒有應(yīng)用價值。 型：與型：與型酶特性類似，也有甲基化功能，但無型酶特性類似，也有甲基化功能，但無ATP酶和酶和DNA解旋解旋酶活力；不同的是它能在酶活力；不同的是它能在DNA鏈上的特異位點切割，其切割位點在識別鏈上的特異位點切割，其切割位點在識別位點以外，對基因工程的意義也不大。位點以外，對基因工程的意義也不大。目目 錄錄限制酶的作用限制酶的作用與甲基化酶共同構(gòu)

11、成細(xì)菌的限制修飾與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源系統(tǒng)，限制外源DNA， 保護(hù)自身保護(hù)自身DNA，猶，猶似高等動物的免疫系統(tǒng)。似高等動物的免疫系統(tǒng)。型：就是通常指的型：就是通常指的DNA限制性內(nèi)切酶，在基因工限制性內(nèi)切酶，在基因工程技術(shù)中常用。特點：分子量小，僅需程技術(shù)中常用。特點：分子量小，僅需Mg2+作為催化作為催化反應(yīng)輔助因子，它們能識別雙鏈反應(yīng)輔助因子，它們能識別雙鏈DNA的特異順序，并的特異順序，并在這個順序內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的在這個順序內(nèi)進(jìn)行切割，產(chǎn)生特異的DNA片段。片段。 類類酶識別序列特點為酶識別序列特點為回文結(jié)構(gòu)，一般為回文結(jié)構(gòu)，一般為46bps（有些為（有些

12、為8或或8個以上堿基序列）個以上堿基序列） ，且富含，且富含GC。GGATCCCCTAGG目目 錄錄第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫斜體；第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫斜體；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫斜體；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫斜體；第四個字母（有時無）代表株（可大寫或小寫）；第四個字母（有時無）代表株（可大寫或小寫）；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名命名Hin d 屬屬 種種 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌d株的第三種酶株的第三種酶（一）重組（一）重組DNA技

13、術(shù)中通常使用技術(shù)中通常使用型限制酶型限制酶 目目 錄錄E=Escherichia，埃希氏菌屬，埃希氏菌屬co=coli，大腸桿菌菌種，大腸桿菌菌種R=RY13，菌株名，菌株名I=第一個被分離到的內(nèi)切酶第一個被分離到的內(nèi)切酶命名命名EcoR 屬屬 種種 株株 序序目目 錄錄（二）（二）型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性型限制性內(nèi)切酶具有一些共性和特性1. 具有特定的識別和切割位點具有特定的識別和切割位點 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶識別位點識別位點限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶識別位點識別位點Apa IGGGCCCCCCGGGSma ICCCGGGGGGCCCBamH IGGATCCCCTAGGSau 3A

14、 IGATCCTAGPst ICTGCAGGACGTCNot IGCGGCCGCCGCCGGCGEcoR IGAATTCCTTAAGSfi IGGCCNNNNNGGCCCCGGNNNNNCCGG II II型限制性內(nèi)切酶的識別位點舉例（型限制性內(nèi)切酶的識別位點舉例（示切割位點）示切割位點） 目目 錄錄2. 識別的核苷酸序列通常為回文結(jié)構(gòu)（識別的核苷酸序列通常為回文結(jié)構(gòu)（palindrome） 目目 錄錄目目 錄錄Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口黏端切口黏端切口3. 切割雙鏈切割雙鏈DNA分子后產(chǎn)

15、生黏端或平端分子后產(chǎn)生黏端或平端（sticky end） （blunt end） 目目 錄錄目目 錄錄同尾酶同尾酶（isocaudarner） 有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割割DNA后，產(chǎn)生相同的黏端，后，產(chǎn)生相同的黏端，這樣的酶彼此互稱為同尾這樣的酶彼此互稱為同尾酶酶。這兩個相同的黏端稱為。這兩個相同的黏端稱為配伍末端配伍末端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A4. 不同的酶可以產(chǎn)生同樣的末端不同的酶可以產(chǎn)生同樣的末端 目目

16、 錄錄GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBstCCCGGGGGGCCCCCCCGGCCGGG GXmaCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCCSma能識別同一序列（切割位點可同或不同）但來源不同能識別同一序列（切割位點可同或不同）但來源不同的兩種酶互稱同工異源酶（的兩種酶互稱同工異源酶（isoschizomer）或同裂酶。）或同裂酶。 5. 不同的酶可以識別同一個序列不同的酶可以識別同一個序列 目目 錄錄6. 6. 切割會受其他因素的影響切割會受其他因素的影響 限制性內(nèi)切酶通常不能切割在識別位點內(nèi)有限制性內(nèi)切酶

17、通常不能切割在識別位點內(nèi)有特異堿基甲基化的序列。特異堿基甲基化的序列。 緩沖液或環(huán)境溫度也會影響一些酶的特異性。緩沖液或環(huán)境溫度也會影響一些酶的特異性。例如，例如，EcoR I在正常情況下識別在正常情況下識別“-GAATTC-”序列，但在甘油濃度大于序列，但在甘油濃度大于5%（v/v）或反應(yīng)溫）或反應(yīng)溫度較低時識別序列可變?yōu)槎容^低時識別序列可變?yōu)椤?AATT-”或或“-嘌呤嘌呤嘌呤嘌呤AT嘧啶嘧啶嘧啶嘧啶-”，這種現(xiàn)象稱為星號活性，這種現(xiàn)象稱為星號活性（star activity），以），以EcoR I*表示。表示。目目 錄錄二、二、DNA連接酶用于催化連接酶用于催化DNA片段連接片段連接 D

18、NA連接酶（連接酶（DNA ligase）：催化兩個相鄰的）：催化兩個相鄰的3-OH和和5-磷酸基團形成磷酸基團形成3，5-磷酸二酯鍵，從而使磷酸二酯鍵，從而使DNA片段或單片段或單鏈斷裂形成的缺口連接起來。鏈斷裂形成的缺口連接起來。連接酶的作用機制連接酶的作用機制目目 錄錄BamH I目目 錄錄 1. 大腸桿菌染色體編碼的大腸桿菌染色體編碼的 DNA連接酶連接酶 需需NAD+作為輔因子作為輔因子 2. 大腸桿菌大腸桿菌T4噬菌體噬菌體DNA編碼的編碼的T4 DNA連接酶連接酶 需需ATP作為輔因子作為輔因子 DNA連接酶的來源連接酶的來源目目 錄錄三、重組三、重組DNA 技術(shù)中還需使用其他常

19、用技術(shù)中還需使用其他常用工具酶工具酶（一）（一） 堿性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基團堿性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基團（二）反轉(zhuǎn)錄酶以（二）反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成為模板合成cDNA（三）末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶用于給（三）末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶用于給DNA末端加尾以構(gòu)成末端加尾以構(gòu)成黏黏性末端性末端 （四）（四）DNA聚合酶聚合酶I主要用于合成主要用于合成DNA（五）（五）DNA聚合酶聚合酶I大片段保留了有用的酶活性大片段保留了有用的酶活性（六）（六）Taq DNA聚合酶常用于聚合酶常用于PCR（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸鏈（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸鏈5 羥基末端磷酸化羥基末端磷酸

20、化目目 錄錄 來自于大腸桿菌（來自于大腸桿菌（bacterial alkaline phosphatase，BAP）或小牛腸（或小牛腸（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）。用于）。用于脫去脫去DNA（RNA）5末端的磷酸基團，使末端的磷酸基團，使5 -P成為成為5 -OH，該，該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。過程稱核酸分子的脫磷酸作用。（一）堿性磷酸酶能去除核酸分子末端的（一）堿性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基團磷酸基團 P5OH3OH3P5OH5OH3OH3OH5目目 錄錄（二）反轉(zhuǎn)錄酶以（二）反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成為模板合成cDNA反轉(zhuǎn)錄

21、酶反轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase） 反轉(zhuǎn)錄酶催化的反轉(zhuǎn)錄酶催化的cDNA合成合成RNARNA53AAAAAAAAAAAATTTTTT53cDNAcDNA隨機引物隨機引物Oligo-dT目目 錄錄 5 35533 53OHGGG GGdGTP末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶（三）末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶用于給（三）末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶用于給DNA末端末端加尾以構(gòu)成黏端加尾以構(gòu)成黏端 目目 錄錄 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I（DNA polymerase I）是基因工程中常用的）是基因工程中常用的DNA聚合酶。其除聚合酶。其除具有具有53聚合酶活性外，還有聚合酶活性外，還有35及及5

22、3核酸外切酶活性。因其具有核酸外切酶活性。因其具有53核酸核酸外切酶活性而常用于外切酶活性而常用于DNA探針的缺口平移法探針的缺口平移法（nick translation）標(biāo)記。）標(biāo)記。 （四）（四）DNA聚合酶聚合酶I主要用于合成主要用于合成DNA目目 錄錄 DNA聚合酶聚合酶I大片段（大片段（large fragment of DNA polymerase I）為為DNA聚合酶聚合酶I用枯草桿菌蛋白酶（用枯草桿菌蛋白酶（subtilisin）裂解后產(chǎn)生的大）裂解后產(chǎn)生的大片段，這個片段也稱為片段，這個片段也稱為Klenow片段（片段（Klenow fragment）。其）。其保留了保留了5

23、3聚合酶活性及聚合酶活性及3 5外切酶活性，失去了外切酶活性，失去了5 3外外切酶活性。它具有的切酶活性。它具有的35外切酶活性能保證外切酶活性能保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確復(fù)制的準(zhǔn)確性，即把性，即把DNA合成過程中錯配的核苷酸去除，再把正確的核苷合成過程中錯配的核苷酸去除，再把正確的核苷酸接上去（該活性稱為校對活性）。酸接上去（該活性稱為校對活性）。 Klenow片段的主要用途有：片段的主要用途有： 補齊雙鏈補齊雙鏈DNA的的3末端，末端，使其轉(zhuǎn)變成平端；或通過補齊使其轉(zhuǎn)變成平端；或通過補齊3端而使端而使3末端標(biāo)記；末端標(biāo)記； 在在cDNA克隆中，用于第二股鏈的合成；克隆中，用于第二股鏈的合成； 用

24、于用于DNA序列分析。序列分析。（五）五）DNA聚合酶聚合酶I大片段保留了有用的酶活性大片段保留了有用的酶活性目目 錄錄將黏端轉(zhuǎn)變成平端將黏端轉(zhuǎn)變成平端GC T T A A OH 35 35GA A T TC T T A A5335 對對5-黏端片段，利用大腸桿菌黏端片段，利用大腸桿菌DNA聚合酶聚合酶I的的Klenow片段，在片段，在3-OH端延伸，可填平末端的凹陷并端延伸，可填平末端的凹陷并將其轉(zhuǎn)變成平端將其轉(zhuǎn)變成平端。DNADNA聚合酶聚合酶 EcoR目目 錄錄將黏端轉(zhuǎn)變成平端將黏端轉(zhuǎn)變成平端C T G C AG 5 35CG533 對對3黏端的片段，應(yīng)用如黏端的片段，應(yīng)用如T4 DNA

25、聚合酶的聚合酶的35的核酸的核酸外切酶活性可切去未配對的序列，將其轉(zhuǎn)變成平端。外切酶活性可切去未配對的序列，將其轉(zhuǎn)變成平端。核酸外切酶核酸外切酶 PstPst 53目目 錄錄（六）（六）Taq DNA聚合酶常用于聚合酶常用于PCR Taq DNA聚合酶具有良好的聚合活性和熱穩(wěn)定聚合酶具有良好的聚合活性和熱穩(wěn)定性，常用于性，常用于PCR。該酶具有。該酶具有53聚合酶活性及聚合酶活性及53外切酶活性，但沒有外切酶活性，但沒有35外切酶活性，因而外切酶活性，因而無無35校對活性，故在校對活性，故在PCR反應(yīng)中如果發(fā)生堿基反應(yīng)中如果發(fā)生堿基錯配，該酶沒有校正功能。針對此不足，目前研發(fā)錯配，該酶沒有校正

26、功能。針對此不足，目前研發(fā)出多種高保真耐高溫出多種高保真耐高溫DNA聚合酶，大大降低了聚合酶，大大降低了PCR過程中的堿基錯配率。過程中的堿基錯配率。 另外，另外，Taq DNA聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶作用，聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶作用，能在所合成能在所合成DNA鏈的鏈的3末端加上一個單獨的腺苷酸末端加上一個單獨的腺苷酸殘基（殘基（A）。這樣的）。這樣的PCR產(chǎn)物可直接與帶有產(chǎn)物可直接與帶有3-T的線的線性化載體（性化載體（T載體）連接（即載體）連接（即T-A克?。??？寺。Ｄ磕?錄錄（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸鏈（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸鏈5 5 羥基末端磷酸化羥基末端磷酸化 常 用 的 是常

27、 用 的 是 T 4 多 核 苷 酸 激 酶 （多 核 苷 酸 激 酶 （ T 4 polynucleotide kinase），該酶含），該酶含5多核苷酸多核苷酸激酶和激酶和3磷酸酶活性，能催化磷酸酶活性，能催化ATP的的-位磷位磷酸向酸向DNA和和RNA的的5-羥基轉(zhuǎn)移。羥基轉(zhuǎn)移。 該酶常用于：該酶常用于： DNA或或RNA的的5末端標(biāo)末端標(biāo)記；記； 使沒有使沒有5-末端磷酸的末端磷酸的DNA片段磷酸片段磷酸化，以供連接和克隆之用?；?，以供連接和克隆之用。目目 錄錄第二節(jié)第二節(jié) 目的目的DNA的獲取的獲取Preparation of Interested DNA目目 錄錄一、一、化學(xué)合成法

28、可直接合成目的化學(xué)合成法可直接合成目的DNA 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列物的氨基酸序列應(yīng)用：一般用于小分子肽類基因的合成應(yīng)用：一般用于小分子肽類基因的合成目目 錄錄* 化學(xué)合成法獲取目的化學(xué)合成法獲取目的DNA由已知氨基酸序列推測可能的由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列序列色色 苯丙苯丙 蛋蛋 賴賴目目 錄錄 第一步：構(gòu)建第一步：構(gòu)建（是指包含（是指包含某一個生物細(xì)胞或組織全部基因組某一個生物細(xì)胞或組織全部基因組DNA序列的序列的隨機克隆群體，以隨機克隆群體，以DNA片段的形式貯存了所有片段的形式貯存了所有的基因組的基因組DNA信息

29、）。信息）。 第二步：篩選含有目的基因的克隆。第二步：篩選含有目的基因的克隆。 二、從基因組從基因組DNA文庫中獲取目的文庫中獲取目的DNA目目 錄錄組織或細(xì)胞染色體組織或細(xì)胞染色體DNA基因片段基因片段克隆載體克隆載體重組重組DNA分子分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶或機械剪切或機械剪切受體菌受體菌基因組基因組DNA文庫文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基克隆載體所攜帶的所有基因組因組DNA片段的集合片段的集合* 從基因組從基因組DNA文文庫獲取目的基因庫獲取目的基因目目 錄錄三、從三、從cDNA文庫中獲取目的文庫中獲取目的DNA 第

30、一步：構(gòu)建第一步：構(gòu)建（包含某一組織（包含某一組織細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部細(xì)胞在一定條件下所表達(dá)的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)經(jīng)反轉(zhuǎn)錄而合成的錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存了全部的基因表達(dá)信息）。片段的形式貯存了全部的基因表達(dá)信息）。 第二步：篩選含有目的第二步：篩選含有目的的克隆。的克隆。 目目 錄錄cDNA文庫文庫存 在 于存 在 于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體由克隆載體所攜帶的所所攜帶的所有有cDNA片片段的集合段的集合目目 錄錄基因組基因組DNA文庫和文庫和cDNA文庫的構(gòu)建文庫的構(gòu)建目目 錄錄從從基因組基因組DNA文庫或文庫或cDNA文庫

31、中篩選文庫中篩選目的目的DNA的策略的策略1. 菌落或噬斑原位雜交菌落或噬斑原位雜交2. 針對表達(dá)文庫，可用抗原針對表達(dá)文庫，可用抗原-抗體或配體抗體或配體-受受體結(jié)合的原理（親和篩選法）篩選體結(jié)合的原理（親和篩選法）篩選目目 錄錄* 從 基 因 組從 基 因 組DNA文庫獲文庫獲取目的基因取目的基因菌落原位雜交菌落原位雜交法等方法，可法等方法，可從文庫中篩選從文庫中篩選含有目的基因含有目的基因的噬菌體的噬菌體目目 錄錄AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

32、AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAcDNA synthesisInfect cellscDNA library目目 錄錄 如果已經(jīng)知道目的基因的序列，就能很如果已經(jīng)知道目的基因的序列，就能很方便地用方便地用PCR反應(yīng)，從基因組反應(yīng)，從基因組DNA或或cDNA中中獲得目的基因，可不必要經(jīng)過復(fù)雜的獲得目的基因，可不必要經(jīng)過復(fù)雜的DNA文文庫構(gòu)建過程。庫構(gòu)建過程。PCR是一種高效快速的體外是一種高效快速的體外DNA聚合程序聚合程序四、經(jīng)四、經(jīng)PCR獲取目的獲取目的DNA 目目 錄錄PCR 體系體系 模板模板 引物引物 耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶 dNTPs 含含Mg2+的緩沖液的緩沖液目目 錄

33、錄PCR的過程的過程 變性變性(Denaturing): 經(jīng)加熱使模板經(jīng)加熱使模板DNA 從從 dsDNA 變成變成ssDNA 退火退火(Annealing): 引物與模板引物與模板DNA雜交雜交 延伸延伸(Extension): DNA 合成合成目目 錄錄ing目目 錄錄PCR的頭三的頭三個循環(huán)個循環(huán)目目 錄錄酵母單雜交系統(tǒng)酵母單雜交系統(tǒng)五、通過特異雜交系統(tǒng)獲取某些轉(zhuǎn)錄因子的編碼五、通過特異雜交系統(tǒng)獲取某些轉(zhuǎn)錄因子的編碼DNADNAA. 無轉(zhuǎn)錄因子：報告基因不表達(dá)無轉(zhuǎn)錄因子：報告基因不表達(dá)“誘餌誘餌”DNA序列序列B. 有轉(zhuǎn)錄因子：報告基因表達(dá)有轉(zhuǎn)錄因子：報告基因表達(dá)C. 有轉(zhuǎn)錄因子有轉(zhuǎn)錄因

34、子 AD/DNA結(jié)合蛋白融合蛋白：報告基因表達(dá)結(jié)合蛋白融合蛋白：報告基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄因子的 AD轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白報告基因報告基因報告基因報告基因報告基因報告基因.目目 錄錄. 報告基因報告基因 報告基因報告基因酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng) B. B. 有相互作用的蛋白質(zhì)，報告基因表達(dá)有相互作用的蛋白質(zhì)，報告基因表達(dá) 啟動子啟動子 A. A. 無相互作用的蛋白質(zhì)，報告基因不表達(dá)無相互作用的蛋白質(zhì)，報告基因不表達(dá) “誘餌誘餌”“獵物獵物” AD BD 上游激活序列上游激活序列 啟動子啟動子BD“誘餌誘餌” “獵物獵物”AD上游激活序列上游激活序列目目 錄錄第三節(jié)第三節(jié)

35、重組重組DNA技術(shù)中的技術(shù)中的DNA載體載體DNA Vectors in Recombinant DNA Technology 目目 錄錄載體（載體（vectorvector）是為攜帶感興趣的外源是為攜帶感興趣的外源DNADNA，實現(xiàn)，實現(xiàn)外源外源DNADNA在受體細(xì)胞中的無性繁殖或表達(dá)有意義的在受體細(xì)胞中的無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些蛋白質(zhì)所采用的一些DNADNA分子分子 按功能分按功能分克隆載體（克隆載體（cloning vector）表達(dá)載體（表達(dá)載體（expression vector） 按基本元件按基本元件的來源不同的來源不同質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體噬菌體載體噬菌體載體黏粒載體黏

36、粒載體病毒載體病毒載體人工染色體載體等人工染色體載體等載體概述載體概述目目 錄錄克隆載體克隆載體(cloning vector)為使插入的外源為使插入的外源DNA序列被擴增而特意序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為設(shè)計的載體稱為克隆載體?？寺≥d體。表達(dá)載體表達(dá)載體(expression vector) 為使插入的外源為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄和翻譯序列可轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達(dá)載體。表達(dá)載體。目目 錄錄一、克隆載體用于外源一、克隆載體用于外源DNA的克隆和的克隆和無性繁殖無性繁殖（一）克隆載體應(yīng)具備的主要特點（一）克隆載體應(yīng)具備的主要特點 至少有一個

37、復(fù)制起點（至少有一個復(fù)制起點（origin of replication, ori） 至少有一個選擇性標(biāo)志（至少有一個選擇性標(biāo)志（selection marker） 有適宜的限制性內(nèi)切酶的單一切點：稱為多克隆位有適宜的限制性內(nèi)切酶的單一切點：稱為多克隆位點（點（multiple cloning sites，MCS） 應(yīng)有較高的拷貝數(shù)。應(yīng)有較高的拷貝數(shù)。 pBR322質(zhì)粒圖譜質(zhì)粒圖譜 目目 錄錄1. 1. 質(zhì)粒質(zhì)粒 (plasmid)特點：能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些特點：能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息遺傳信息, , 會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。

38、 （二）（二） 常用克隆載體有多種常用克隆載體有多種目目 錄錄嚴(yán)緊型質(zhì)粒嚴(yán)緊型質(zhì)粒:質(zhì)粒與細(xì)菌染色體同步復(fù)制，處于嚴(yán)質(zhì)粒與細(xì)菌染色體同步復(fù)制，處于嚴(yán)密控制之下，其拷貝數(shù)較低。密控制之下，其拷貝數(shù)較低。松弛型質(zhì)粒松弛型質(zhì)粒:質(zhì)粒的復(fù)制快于細(xì)菌染色體復(fù)制（即質(zhì)粒的復(fù)制快于細(xì)菌染色體復(fù)制（即質(zhì)粒復(fù)制不受嚴(yán)格控制），其拷貝數(shù)很高。重組質(zhì)粒復(fù)制不受嚴(yán)格控制），其拷貝數(shù)很高。重組DNA技術(shù)中使用的質(zhì)粒通常是松弛型。技術(shù)中使用的質(zhì)粒通常是松弛型。不同的質(zhì)粒必須兼容才能共存于同一細(xì)胞中，這不同的質(zhì)粒必須兼容才能共存于同一細(xì)胞中，這對復(fù)合轉(zhuǎn)染（或轉(zhuǎn)化）有參考價值。對復(fù)合轉(zhuǎn)染（或轉(zhuǎn)化）有參考價值。目前，已有一系列

39、商品化質(zhì)?？寺≥d體可供選擇，目前，已有一系列商品化質(zhì)?？寺≥d體可供選擇，如如pUC系列、系列、pGEM系列等。系列等。質(zhì)粒載體通常所能容納的外源質(zhì)粒載體通常所能容納的外源DNA長度在長度在10 kb以內(nèi)，外源以內(nèi)，外源DNA片段越長，質(zhì)粒越不穩(wěn)定。片段越長，質(zhì)粒越不穩(wěn)定。 目目 錄錄pUC系列質(zhì)粒圖譜系列質(zhì)粒圖譜目目 錄錄噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)改造系統(tǒng) gt系列（插入型，適用于系列（插入型，適用于cDNA克?。┛寺。〦MBL系列（置換型，適用于基因組系列（置換型，適用于基因組DNA克?。┛寺。ヽos位點位點:噬菌體噬菌體DNA為線性雙鏈分子，兩端各有一條為線性雙鏈分子，兩端各有一條由由12

40、個堿基組成、彼此完全互補且個堿基組成、彼此完全互補且5單鏈突出的序列單鏈突出的序列（即粘性末端），稱（即粘性末端），稱cos位點位點 2. 噬菌體噬菌體(phage) M13噬菌體噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含改造系統(tǒng)（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列目目 錄錄3. 穿梭載體（穿梭載體（shuttle vector） 人工構(gòu)建，含有不止一個復(fù)制起點，能攜帶外人工構(gòu)建，含有不止一個復(fù)制起點，能攜帶外源源DNA序列在不同種類宿主細(xì)胞中復(fù)制、擴增。序列在不同種類宿主細(xì)胞中復(fù)制、擴增。目目 錄錄u 表達(dá)載體是指用來在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源表達(dá)載體是指用來在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體基因的載體u 依據(jù)其

41、宿主細(xì)胞的不同可分為依據(jù)其宿主細(xì)胞的不同可分為: 原核表達(dá)載體（原核表達(dá)載體（prokaryotic expression vector） 真核表達(dá)載體（真核表達(dá)載體（eukaryotic expression vector） 二、表達(dá)載體用于外源二、表達(dá)載體用于外源DNA的表達(dá)的表達(dá)目目 錄錄（一）（一） 原核表達(dá)載體用于在原核細(xì)胞中表達(dá)外原核表達(dá)載體用于在原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因源基因 從克隆載體發(fā)展而來，其除了具備克隆載體的一般特點外，從克隆載體發(fā)展而來，其除了具備克隆載體的一般特點外，還需有調(diào)控外源基因有效轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列，如啟動子、核糖還需有調(diào)控外源基因有效轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列，如啟動子、

42、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止序列等。目前應(yīng)用最廣泛的原核表達(dá)載體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止序列等。目前應(yīng)用最廣泛的原核表達(dá)載體是大腸桿菌表達(dá)載體。原核表達(dá)載體的基本組成如下：體是大腸桿菌表達(dá)載體。原核表達(dá)載體的基本組成如下：R：調(diào)節(jié)序列；：調(diào)節(jié)序列； P：啟動子；：啟動子； SD：SD序列；序列；TT：轉(zhuǎn)錄終止序列：轉(zhuǎn)錄終止序列大腸桿菌表達(dá)載體大腸桿菌表達(dá)載體目目 錄錄lLac啟動子（乳糖啟動子）啟動子（乳糖啟動子） lTrp啟動子（色氨酸啟動子）啟動子（色氨酸啟動子）lTac啟動子（乳糖和色氨酸的雜合啟動子）啟動子（乳糖和色氨酸的雜合啟動子） lPL和和PR啟動子（啟動子（噬菌體的左向和右向啟動子）噬菌

43、體的左向和右向啟動子） lT7啟動子啟動子1. 1. 啟動子是啟動外源基因表達(dá)的必需元件，其能被啟動子是啟動外源基因表達(dá)的必需元件，其能被RNARNA聚合酶聚合酶所識別：所識別：目前原核表達(dá)載體常使用的啟動子有以下幾種目前原核表達(dá)載體常使用的啟動子有以下幾種 目目 錄錄2. SD序列提供核糖體結(jié)合位點序列提供核糖體結(jié)合位點 mRNA在細(xì)菌中的翻譯嚴(yán)格依賴于核糖體結(jié)合位在細(xì)菌中的翻譯嚴(yán)格依賴于核糖體結(jié)合位點（點（ribosome binding site）的存在。）的存在。SD序列（序列（Shine-Dalgarno sequence）位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游）位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游813 bp處，處

44、，為富含嘌呤的短片段，其能與核糖體為富含嘌呤的短片段，其能與核糖體30S小亞基中的小亞基中的16S rRNA 3端的部分序列互補結(jié)合。端的部分序列互補結(jié)合。SD序列作為核糖體結(jié)序列作為核糖體結(jié)合位點，保證了翻譯起始復(fù)合物的形成。合位點，保證了翻譯起始復(fù)合物的形成。目目 錄錄3. 轉(zhuǎn)錄終止序列有助于外源基因的高效表達(dá)轉(zhuǎn)錄終止序列有助于外源基因的高效表達(dá) 盡管載體中沒有轉(zhuǎn)錄終止序列，也可表達(dá)某些外源蛋盡管載體中沒有轉(zhuǎn)錄終止序列，也可表達(dá)某些外源蛋白，但表達(dá)效果通常不理想。因此，多數(shù)原核表達(dá)載體中白，但表達(dá)效果通常不理想。因此，多數(shù)原核表達(dá)載體中都帶有轉(zhuǎn)錄終止序列。都帶有轉(zhuǎn)錄終止序列。 轉(zhuǎn)錄終止序列

45、長短不一，短的只有幾十轉(zhuǎn)錄終止序列長短不一，短的只有幾十bp，長的可達(dá)，長的可達(dá)幾百幾百bp。 轉(zhuǎn)錄終止序列有助于使轉(zhuǎn)錄終止序列有助于使RNA聚合酶重點轉(zhuǎn)錄克隆的外聚合酶重點轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，控制所轉(zhuǎn)錄源基因，控制所轉(zhuǎn)錄RNA的長度，提高的長度，提高RNA穩(wěn)定性。穩(wěn)定性。 位于啟動子上游的轉(zhuǎn)錄終止序列可阻止其他啟動子的位于啟動子上游的轉(zhuǎn)錄終止序列可阻止其他啟動子的通讀，降低本底；位于多克隆位點下游的轉(zhuǎn)錄終止序列可通讀，降低本底；位于多克隆位點下游的轉(zhuǎn)錄終止序列可防止因外源基因表達(dá)而干擾載體的穩(wěn)定性。防止因外源基因表達(dá)而干擾載體的穩(wěn)定性。目目 錄錄4. 幾種常見的原核表達(dá)載體各有特點幾種常見的

46、原核表達(dá)載體各有特點 依據(jù)表達(dá)目的蛋白的方式，可將原核表達(dá)載體分為依據(jù)表達(dá)目的蛋白的方式，可將原核表達(dá)載體分為 （1）非融合型表達(dá)載體）非融合型表達(dá)載體 （2）融合型表達(dá)載體）融合型表達(dá)載體 （3）分泌型表達(dá)載體）分泌型表達(dá)載體 目目 錄錄（1）非融合型表達(dá)載體用于表達(dá)非融合蛋白）非融合型表達(dá)載體用于表達(dá)非融合蛋白 非融合蛋白是指不與細(xì)菌的任何蛋白或多肽融合在一起進(jìn)非融合蛋白是指不與細(xì)菌的任何蛋白或多肽融合在一起進(jìn)行表達(dá)的蛋白。表達(dá)該類蛋白的載體稱為非融合型表達(dá)載體。行表達(dá)的蛋白。表達(dá)該類蛋白的載體稱為非融合型表達(dá)載體。使用強啟動子使用強啟動子tac，緊接，緊接tac啟動子啟動子的是多克隆位點

47、，目的基因克隆于的是多克隆位點，目的基因克隆于啟動子和啟動子和SD序列下游。在多克隆位序列下游。在多克隆位點下游包含一個很強的點下游包含一個很強的rrnB核糖體核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄終止子，其作用是為了的轉(zhuǎn)錄終止子，其作用是為了穩(wěn)定載體系統(tǒng)，因為上游強的穩(wěn)定載體系統(tǒng)，因為上游強的tac啟啟動子控制的轉(zhuǎn)錄必須由強終止子抑動子控制的轉(zhuǎn)錄必須由強終止子抑制，才不至于干擾與載體本身穩(wěn)定制，才不至于干擾與載體本身穩(wěn)定性有關(guān)的基因表達(dá)。載體的其余部性有關(guān)的基因表達(dá)。載體的其余部分來自分來自pBR322。使用使用pKK223-3時，應(yīng)配套使用時，應(yīng)配套使用LacIq宿主菌，在無宿主菌，在無IPTG誘導(dǎo)時，誘導(dǎo)時

48、，tac啟動子受阻遏，當(dāng)加入啟動子受阻遏，當(dāng)加入IPTG后，后，便可去阻遏，從而使外源基因表達(dá)。便可去阻遏，從而使外源基因表達(dá)。 目目 錄錄將一段特殊的蛋白質(zhì)（或短將一段特殊的蛋白質(zhì)（或短肽）的基因構(gòu)建入載體，使肽）的基因構(gòu)建入載體，使之與目的蛋白融合表達(dá)可形之與目的蛋白融合表達(dá)可形成 融 合 蛋 白 （成 融 合 蛋 白 （ f u s i o n protein）。表達(dá)該類蛋白的）。表達(dá)該類蛋白的載體稱為融合型表達(dá)載體，載體稱為融合型表達(dá)載體，如如pGEX系統(tǒng)。系統(tǒng)。pGEX系統(tǒng)包括多種載體，系統(tǒng)包括多種載體，如如pGEX-lT、pGEX-2T、pGEX-3X、pGEX-4T、pGEX-5

49、X、pGEX-6P等。該等。該系統(tǒng)載體使用強啟動子系統(tǒng)載體使用強啟動子tac，緊接啟動子的是緊接啟動子的是SD序列及其序列及其下游的下游的GST基因，然后是多基因，然后是多克隆位點。用克隆位點。用IPTG可誘導(dǎo)目可誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物與的基因的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物與GST融合，故可利用該標(biāo)簽融合，故可利用該標(biāo)簽對蛋白進(jìn)行純化對蛋白進(jìn)行純化。 （2）融合型表達(dá)載體用于表達(dá)融合蛋白）融合型表達(dá)載體用于表達(dá)融合蛋白目目 錄錄該類載體的優(yōu)點是能把在受體細(xì)菌內(nèi)表達(dá)的外源蛋白有效地分泌到周質(zhì)腔，該類載體的優(yōu)點是能把在受體細(xì)菌內(nèi)表達(dá)的外源蛋白有效地分泌到周質(zhì)腔，甚至穿過細(xì)胞外膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。甚至穿過細(xì)胞外

50、膜進(jìn)入培養(yǎng)基中。在構(gòu)建該類載體時，除有一般表達(dá)載體應(yīng)有的啟動子等元件外，還需含有在構(gòu)建該類載體時，除有一般表達(dá)載體應(yīng)有的啟動子等元件外，還需含有編碼信號肽的序列（通常置于編碼信號肽的序列（通常置于SD序列下游）。序列下游）。分泌型載體既可用于非融合蛋白的表達(dá)，也可用于融合蛋白的表達(dá)。分泌型載體既可用于非融合蛋白的表達(dá)，也可用于融合蛋白的表達(dá)。pIN 系列載體是較常用的分泌型表達(dá)載體，可使所表達(dá)的蛋白分泌到宿系列載體是較常用的分泌型表達(dá)載體，可使所表達(dá)的蛋白分泌到宿主菌的周質(zhì)腔中。該系列載體以主菌的周質(zhì)腔中。該系列載體以pBR322為基礎(chǔ)構(gòu)建而成，帶有大腸桿菌中為基礎(chǔ)構(gòu)建而成，帶有大腸桿菌中最強

51、的啟動子之一，即最強的啟動子之一，即lpp（脂蛋白基因）啟動子，其中編碼信號肽的序列（脂蛋白基因）啟動子，其中編碼信號肽的序列取自大腸桿菌中分泌蛋白的基因取自大腸桿菌中分泌蛋白的基因ompa （外膜蛋白基因）。（外膜蛋白基因）。 （3 3）分泌型表達(dá)載體用于外源基因的分泌表達(dá)）分泌型表達(dá)載體用于外源基因的分泌表達(dá)pIN 系列載體有系列載體有3種，即種，即pIN -ompA1、pIN -ompA2和和pIN -ompA3，分別適用，分別適用于使用不同密碼子框架的目的基因的插入，于使用不同密碼子框架的目的基因的插入，克隆位點分別為克隆位點分別為EcoR、Hind和和BamH。目目 錄錄（二）真核表

52、達(dá)載體用于在真原核細(xì)胞中（二）真核表達(dá)載體用于在真原核細(xì)胞中表達(dá)外源基因表達(dá)外源基因 真核表達(dá)載體包括在大腸桿菌中起作用的復(fù)制起始位真核表達(dá)載體包括在大腸桿菌中起作用的復(fù)制起始位點、抗生素抗性基因、多克隆位點等。點、抗生素抗性基因、多克隆位點等。真核表達(dá)載體中還具有：真核表達(dá)載體中還具有： 真核表達(dá)調(diào)控元件：包括啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終真核表達(dá)調(diào)控元件：包括啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止序列、止序列、poly A 加尾信號等加尾信號等 真核細(xì)胞復(fù)制起始序列真核細(xì)胞復(fù)制起始序列 真核細(xì)胞藥物抗性基因真核細(xì)胞藥物抗性基因目目 錄錄OriPro：原核復(fù)制起始序列；：原核復(fù)制起始序列；P：啟動子；：啟動子；M

53、CS：多克?。憾嗫寺∥稽c；位點；TT：轉(zhuǎn)錄終止序列；：轉(zhuǎn)錄終止序列；orieuk：真核復(fù)制起始序列。：真核復(fù)制起始序列。注：不是所有真核表達(dá)載體都有整合序列注：不是所有真核表達(dá)載體都有整合序列 真核表達(dá)載體的基本組成真核表達(dá)載體的基本組成 目目 錄錄真核啟動子和增強子在不同類型細(xì)胞中的活性差別很真核啟動子和增強子在不同類型細(xì)胞中的活性差別很大。某些來源于病毒的啟動子和增強子，其真核宿主細(xì)胞大。某些來源于病毒的啟動子和增強子，其真核宿主細(xì)胞范圍較廣，如范圍較廣，如Rous肉瘤病毒基因組長末端重復(fù)序列（肉瘤病毒基因組長末端重復(fù)序列（long terminal repeats，LTR）、）、SV40

54、病毒早期基因的啟動子和病毒早期基因的啟動子和增強子、人類巨細(xì)胞病毒（增強子、人類巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動子等。這些啟動子）啟動子等。這些啟動子和增強子組合可在廣泛的宿主細(xì)胞中起作用，故在真核表和增強子組合可在廣泛的宿主細(xì)胞中起作用，故在真核表達(dá)載體中被普遍使用。達(dá)載體中被普遍使用。 目目 錄錄真核表達(dá)載體帶有的真核表達(dá)載體帶有的poly A 加尾信號可保證新轉(zhuǎn)加尾信號可保證新轉(zhuǎn)錄的錄的mRNA能有效地加上能有效地加上poly A。為為mRNA加上加上poly A依賴于依賴于mRNA 3末端的末端的AAUAAA和其下游的和其下游的GU或或U富含區(qū)。富含區(qū)。盡管全長盡管全長cDNA克隆可能已帶有克

55、隆可能已帶有AAUAAA序列和序列和一段一段poly A，但這些序列仍不足以保證，但這些序列仍不足以保證poly A的有效形的有效形成。因此，載體中必須帶有成。因此，載體中必須帶有poly A 加尾信號。加尾信號。常用的來自常用的來自SV40的的poly A加尾信號為加尾信號為237 bp，其，其中同時含有針對早期和晚期轉(zhuǎn)錄子的切割和中同時含有針對早期和晚期轉(zhuǎn)錄子的切割和poly A 加加尾信號。兩套信號作用的方向相反，并分別位于不同尾信號。兩套信號作用的方向相反，并分別位于不同的的DNA鏈上，對鏈上，對mRNA的加工均很有效。的加工均很有效。目目 錄錄酵母表達(dá)載體酵母表達(dá)載體昆蟲表達(dá)載體昆蟲

56、表達(dá)載體哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體根據(jù)真核宿主細(xì)胞的不同，真核表達(dá)載體可主要根據(jù)真核宿主細(xì)胞的不同，真核表達(dá)載體可主要分為分為 ：目目 錄錄（1 1）酵母表達(dá)載體適于在酵母細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白）酵母表達(dá)載體適于在酵母細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白 根據(jù)載體在酵母細(xì)胞中復(fù)制方式的不同，可將酵根據(jù)載體在酵母細(xì)胞中復(fù)制方式的不同，可將酵母載體分為五類，母載體分為五類， YIp：酵母整合型質(zhì)粒：酵母整合型質(zhì)粒 YRp：酵母復(fù)制型質(zhì)粒：酵母復(fù)制型質(zhì)粒 YCp：酵母著絲粒型質(zhì)粒：酵母著絲粒型質(zhì)粒 YEp：酵母游離型質(zhì)粒：酵母游離型質(zhì)粒 YLp：酵母線性質(zhì)粒：酵母線性質(zhì)粒 除除YLp外，其余各類既可在大腸桿菌，

57、又可在酵外，其余各類既可在大腸桿菌，又可在酵母細(xì)胞中復(fù)制與擴增。母細(xì)胞中復(fù)制與擴增。目目 錄錄 根據(jù)在轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞中的復(fù)制機制，又可根據(jù)在轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞中的復(fù)制機制，又可將酵母載體分為兩個基本類型：將酵母載體分為兩個基本類型： 整合型載體，如整合型載體，如YIp包含一個酵母包含一個酵母ura3標(biāo)標(biāo)志基因、大腸桿菌復(fù)制起始序列以及抗生素抗志基因、大腸桿菌復(fù)制起始序列以及抗生素抗性基因。該質(zhì)粒缺乏在酵母細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)性基因。該質(zhì)粒缺乏在酵母細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制的元件，其需通過質(zhì)粒制的元件，其需通過質(zhì)粒DNA與酵母與酵母DNA同源同源序列重組而整合至酵母基因組中序列重組而整合至酵母基因組中 。 自主復(fù)

58、制型載體，這類載體因在酵母細(xì)胞自主復(fù)制型載體，這類載體因在酵母細(xì)胞中有自我復(fù)制能力而得名，屬于這類載體的有：中有自我復(fù)制能力而得名，屬于這類載體的有：YRp、YEp和和YCp。 目目 錄錄 YRp含有酵母自主復(fù)制序列，但轉(zhuǎn)化后缺乏有效的分離，含有酵母自主復(fù)制序列，但轉(zhuǎn)化后缺乏有效的分離，故在有絲分裂后，質(zhì)粒在親代細(xì)胞分布極多而在子代細(xì)胞故在有絲分裂后，質(zhì)粒在親代細(xì)胞分布極多而在子代細(xì)胞較少或丟失，在遺傳學(xué)方面極不穩(wěn)定。較少或丟失，在遺傳學(xué)方面極不穩(wěn)定。 YEp具有可誘導(dǎo)型的啟動子、信號肽編碼序列（常用交配具有可誘導(dǎo)型的啟動子、信號肽編碼序列（常用交配因子因子序列）和酵母質(zhì)粒的序列）和酵母質(zhì)粒的

59、2m環(huán)片段，此類質(zhì)?？稍谌经h(huán)片段，此類質(zhì)粒可在染色體外自主復(fù)制（約色體外自主復(fù)制（約50100拷貝拷貝/細(xì)胞），其轉(zhuǎn)化效率高細(xì)胞），其轉(zhuǎn)化效率高且質(zhì)粒穩(wěn)定，因此常用該類載體在酵母細(xì)胞中高效表達(dá)外且質(zhì)粒穩(wěn)定，因此常用該類載體在酵母細(xì)胞中高效表達(dá)外源基因。源基因。 YCp是由自主復(fù)制序列與著絲點序列連接而成，該類載體是由自主復(fù)制序列與著絲點序列連接而成，該類載體的特征是單拷貝（的特征是單拷貝（12拷貝拷貝/細(xì)胞），遺傳性極其穩(wěn)定。細(xì)胞），遺傳性極其穩(wěn)定。著絲點序列存在于酵母細(xì)胞每條染色體中，該序列在有絲著絲點序列存在于酵母細(xì)胞每條染色體中，該序列在有絲分裂和減數(shù)分裂中能使染色體穩(wěn)定而準(zhǔn)確地復(fù)制，這

60、是保分裂和減數(shù)分裂中能使染色體穩(wěn)定而準(zhǔn)確地復(fù)制，這是保持該類載體穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。持該類載體穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。目目 錄錄（2）昆蟲表達(dá)載體可在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)真核基因）昆蟲表達(dá)載體可在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)真核基因 昆蟲表達(dá)載體主要有兩類：昆蟲表達(dá)載體主要有兩類： 桿狀病毒表達(dá)載體。載體的啟動子為多角體蛋桿狀病毒表達(dá)載體。載體的啟動子為多角體蛋白白(polyhedrin)基因的啟動子，所使用的外泌信號基因的啟動子，所使用的外泌信號序列來自蜜蜂的序列來自蜜蜂的milittin序列，其可在宿主細(xì)胞序列，其可在宿主細(xì)胞（如（如Sf9或或Sf20）中高水平表達(dá)外源蛋白。）中高水平表達(dá)外源蛋白。 果蠅表達(dá)載體。載體上

61、的啟動子有果蠅表達(dá)載體。載體上的啟動子有Ac5（果蠅（果蠅黑素激動蛋白黑素激動蛋白5C基因）啟動子和基因）啟動子和MT（果蠅黑素（果蠅黑素金屬硫蛋白基因）啟動子，所使用的外泌信號序金屬硫蛋白基因）啟動子，所使用的外泌信號序列為列為Bip序列，其可連續(xù)表達(dá)或誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白。序列，其可連續(xù)表達(dá)或誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白。目目 錄錄（3 3）哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體適宜在哺乳類細(xì)胞中）哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體適宜在哺乳類細(xì)胞中表達(dá)真核基因表達(dá)真核基因 據(jù)載體進(jìn)入宿主細(xì)胞的方式分為病毒載體和質(zhì)粒載體據(jù)載體進(jìn)入宿主細(xì)胞的方式分為病毒載體和質(zhì)粒載體 據(jù)載體在宿主細(xì)胞內(nèi)是否整合于細(xì)胞染色體據(jù)載體在宿主細(xì)胞內(nèi)是否整合于細(xì)胞染色

62、體DNADNA，可將其，可將其分為整合型和非整合型載體分為整合型和非整合型載體 整合型載體一般是隨機整合入染色體，但所攜帶外源基因整合型載體一般是隨機整合入染色體，但所攜帶外源基因的表達(dá)受插入位點的影響，同時還可能會改變宿主細(xì)胞的的表達(dá)受插入位點的影響，同時還可能會改變宿主細(xì)胞的生長特性，整合型載體通常用于外源基因的穩(wěn)定表達(dá)；非生長特性，整合型載體通常用于外源基因的穩(wěn)定表達(dá)；非整合型載體通常用于外源基因的瞬時表達(dá)整合型載體通常用于外源基因的瞬時表達(dá) 最常用的哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體是病毒載體最常用的哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體是病毒載體 目目 錄錄一個理想的病毒表達(dá)載體，通常應(yīng)具備以下條件：一個理想的病毒表達(dá)

63、載體，通常應(yīng)具備以下條件： 使用安全，對宿主細(xì)胞無毒副效應(yīng)；使用安全，對宿主細(xì)胞無毒副效應(yīng)； 能容納較大的外源能容納較大的外源DNA片段且轉(zhuǎn)染效率高；片段且轉(zhuǎn)染效率高； 所產(chǎn)生的病毒效價高；所產(chǎn)生的病毒效價高； 外源基因在靶組織或靶細(xì)胞中能長期、穩(wěn)定表達(dá)外源基因在靶組織或靶細(xì)胞中能長期、穩(wěn)定表達(dá) 病毒的靶向性強；病毒的靶向性強； 外源基因的表達(dá)具有可控性。外源基因的表達(dá)具有可控性。 然而，遺憾的是，到目前為止，還沒有任何一然而，遺憾的是，到目前為止，還沒有任何一個病毒載體能滿足以上全部理想條件。個病毒載體能滿足以上全部理想條件。 目目 錄錄 病毒表達(dá)載體由各種病毒病毒表達(dá)載體由各種病毒DNA衍

64、生而來，其衍生而來，其構(gòu)建時一般都把細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制起點放置其中，構(gòu)建時一般都把細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制起點放置其中，使病毒載體及其所攜帶的目的使病毒載體及其所攜帶的目的DNA能方便地能方便地在細(xì)菌中繁殖和克隆，然后再轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞。在細(xì)菌中繁殖和克隆，然后再轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞。 經(jīng)過質(zhì)?；慕ǖ牟《据d體通常都包括病毒經(jīng)過質(zhì)?；慕ǖ牟《据d體通常都包括病毒啟動子、包裝元件、遺傳標(biāo)記和質(zhì)粒復(fù)制起啟動子、包裝元件、遺傳標(biāo)記和質(zhì)粒復(fù)制起點等幾個部分。點等幾個部分。目目 錄錄目前，常用的病毒表達(dá)載體包括如下多種：目前，常用的病毒表達(dá)載體包括如下多種： 反轉(zhuǎn)錄病毒（反轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus,RV）載體）載體 l RV屬

65、屬ssRNA病毒。病毒。l 構(gòu)建構(gòu)建RV載體時，將載體時，將RV的的DNA插入插入pBR322質(zhì)粒，質(zhì)粒，同時刪除同時刪除RV的三個編碼基因，保留兩端的的三個編碼基因，保留兩端的LTR和和病毒顆粒包裝序列病毒顆粒包裝序列，再加入供篩選的標(biāo)記基因。，再加入供篩選的標(biāo)記基因。5LTR具啟動子和增強子活性并具轉(zhuǎn)錄起始信號，具啟動子和增強子活性并具轉(zhuǎn)錄起始信號，3LTR具轉(zhuǎn)錄終止信號。具轉(zhuǎn)錄終止信號。l RV載體具有較高整合和表達(dá)外源基因的能力，廣載體具有較高整合和表達(dá)外源基因的能力，廣泛用于轉(zhuǎn)基因動物和基因治療研究，但因其隨機泛用于轉(zhuǎn)基因動物和基因治療研究，但因其隨機整合，其安全性問題需加以考慮。整

66、合，其安全性問題需加以考慮。 目目 錄錄 慢病毒（慢病毒（lentivirus,LV）載體）載體l LV載體是以載體是以HIV-1（I型人類免疫缺陷病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展型人類免疫缺陷病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的表達(dá)載體；起來的表達(dá)載體；l 與一般與一般RV載體不同的是，它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均載體不同的是，它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力；具有感染能力；l 該載體可將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而獲該載體可將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而獲得持久表達(dá)；得持久表達(dá)；l 該載體宿主細(xì)胞較廣，在表達(dá)目的蛋白和小干擾該載體宿主細(xì)胞較廣，在表達(dá)目的蛋白和小干擾RNA方面方面都有廣泛應(yīng)用都有廣泛應(yīng)用 。目目 錄錄 腺病毒（腺病毒（Adenovirus,AV）載體）載體 l AV屬線性屬線性dsDNA病毒；病毒；l 目前，普遍使用的是目前，普遍使用的是AV第三代載體，載體中去除了所第三代載體，載體中去除了所有有AV的編碼基因，僅保留了的編碼基因，僅保留了5和和3末端反向重復(fù)序列末端反向重復(fù)序列（inverted terminal repeats，ITR）及病毒包裝序列）及病毒包裝序列，