《大豆食品中異黃酮含量的測定》行業(yè)標準編制說明

大豆食品中異黃酮含量的測定 行業(yè)標準 編制 說明 （ 征求意見稿 ） 一、任務來源 2016年 3月 22 日，由 中國食品工業(yè)協(xié)會豆制品專業(yè)委員會申請行業(yè)標準的立項，根據(jù)工業(yè)和信息化部下達的 2016 年第一季度行業(yè)標準制修訂計劃 ，批準大豆食品中異黃酮含量的測定 推薦性行業(yè)標準的制定 本標準由中國食品工業(yè)協(xié)會豆制品專業(yè)委員會組織 制定 工作。 二、標準的屬性 本標準是推薦性行業(yè)標準。 三、標準的修訂原則 （一）按照食品安全法的相關規(guī)定，對現(xiàn)行有關大豆異黃酮含量的測定相關標準進行梳理； （二）結(jié)合國內(nèi)豆制品企業(yè)生產(chǎn)實際情 況，參考國際相關標準； （三）統(tǒng)籌考慮與食品安全國家標準 豆制品有效銜接，確保標準的適用性、廣泛性、可操作性。 本標準的編寫符合 準化工作導則第 1部分：標準的結(jié)構和編寫。 四 、標準 主要內(nèi)容 制定 情況 1、大豆異黃酮是一類從大豆中分離出來的具有生理活性的物質(zhì)，近年來被確定為抗腫瘤作用的功能因子，能夠預防和治療乳腺癌 、結(jié)腸癌和皮膚癌，改善骨質(zhì)疏松，能夠緩解和減輕女性更年期不適癥狀，同時可提高機體免疫功能，抗氧化、抗溶血、降低心血管疾病和冠心病的發(fā)生。因此制定科學有效的大豆制品中異黃酮含量的測 定方法非常重要。 目前，大豆異黃酮的檢測主要有高效液相色譜法（ 高效液相色譜 液質(zhì)聯(lián)用法具有高分辨、高分離能力且靈敏度高等優(yōu)點，但儀器設備昂貴 ， 難以普及 。 具有分離效果好、準確度高、重現(xiàn)性好、分析速度快和自動化程度高等優(yōu)點，被廣泛采用。結(jié)合我國豆制品行業(yè)生產(chǎn)企業(yè)現(xiàn)狀，采用 實驗的可操作性、檢測成本費用、 應用的廣泛性 等幾方面的 問題綜合考慮較為實際，且本標準中測定方法與其他 有同時測定 12種大豆異黃酮單體的含量 的優(yōu)點 。 2、 本標準（國家大 豆產(chǎn)業(yè)技術研發(fā)中心加工研究室）方法： 標準品制備 ：準確稱取 1 準品置于儲液瓶中，以 1:1:2 的比例（體積比）向其中加入 二 甲基 亞 砜 (乙腈， 80%的甲醇溶液，充分溶液標準品，配制成 1 mg/原始溶液。單一標準品標準溶液的配制：使用 80%的甲醇溶液將原始 溶液 稀釋成 100 g/單標 標準溶液?；旌蠘藴势窐藴嗜芤旱呐渲疲旱攘课「鳂藴势吩夯旌?，加 80%的甲醇溶液配制成 100 g/標標準溶液原液，并逐步稀釋配制成 1 60g/同濃度梯度溶液以制作標準曲線 . 樣品處理 方法是將樣品冷凍干燥制成粉末，準確稱取樣品粉末，置于離心管中，按 1:10（ g： 的比例向其中加入等體積的 乙腈 和超純水，密封后充分混勻， 使用搖床在 300 r/溫下震蕩提取 2h。然后使用離心機在 6000 r/0 清液通過慢速定量濾紙進行過濾。濾液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在 35 條件下蒸發(fā)至干，向其中加入 5 0%的甲醇溶液以溶解干物質(zhì)，通過 m 的有機系過濾器過濾處理過后的樣品溶液，除 去不容物。在 件下冷凍保存?zhèn)溆谩?試驗數(shù)據(jù)通過 作站進行記錄，數(shù)據(jù)分析采用 3、本標準試驗方法 中色譜條件： 色譜柱： 5m、 4.6 250 流動相 A：含有 酸的超純水溶液； 流動相 B：含有 酸的乙腈溶液； 柱溫： 35 ； 進樣量： 20 L； 檢測波長 ： 262 流速 ： 1.2 mL/ 4、本標準采用的方法的確定過程： 1） 對洗脫梯度的 確定 ： 試驗中發(fā)現(xiàn)，丙二?；玖夏拒蘸鸵阴；S豆黃苷非常難以分離，通過對流動相比例的細微改變，在保證上述兩種物質(zhì)完全分離的情況下，同時也要保 證其他的單體峰很好的分離，在進行了大量實驗對比 ，證明圖 1所示的洗脫梯度較為有效，對 12種異黃酮的標品分離如圖 2所示。 圖 1 優(yōu)化后的流 動相洗脫梯度 圖 2 標準品 譜圖 1 大豆苷； 7 丙二酰基染料木苷； 2 黃豆黃苷； 8 乙?；S豆黃苷； 3 丙二?；蠖管?； 9 大豆苷元； 4 丙二?；S豆黃苷； 10 黃豆黃素； 5 染料木苷； 11 乙?；玖夏拒眨?6 乙?；蠖管?； 12 染料木素 2） 對流速的 確定 ：在對 12種大豆異黃酮單體進行一次分離的同時，分別 對流動相流速 1.2 mL/行了試驗，結(jié)果表明： 1.2 mL/流速能夠有效的分開各種大豆異黃酮單體而且能夠節(jié)約單次試驗時間。 3）對進樣量的 確定 ：試驗通過對 10 L 和 20 L 不 同進樣量的對比得出：進樣量對出峰時間以及進樣器定量環(huán)為 20 L，為使試驗結(jié)果更為精密可靠，試驗采用 20 L 為進樣體積。 4） 定量分析方法的建立： 通過對單一標準品的 到每一種標準品對應的出峰時間，并在混合標準品的色譜圖中找出對應的標準品。出峰的順序為大豆苷 （ D） 、黃豆黃苷 （ 、丙二?；蠖管?（ 、丙二?；S豆黃苷 （ 、染料木苷 （ G） 、乙?；蠖管?（ 、丙二?；玖夏拒?（ 、乙?；S豆黃苷（ 、大豆苷元 （ 、黃豆黃素 （ 、乙?；玖夏拒?（ 、染料木素 （ ；出峰時間分別為： 通過對不同濃度梯度混合標準品標準溶液的夠得出 12種大豆異黃酮單體濃度與峰面積具有良好的線性關系，見表 1。 表 1 大豆異黃酮各組分回歸方程 5） 精密度與穩(wěn)定性試驗： 對 12種異黃酮組分混合標準品進行日內(nèi)穩(wěn)定性及日間穩(wěn)定性測定，本方法具有良好的精密度與較好的穩(wěn)定性，測定結(jié)果見表 2。 由表 2可知：本標準方法日內(nèi)與日間穩(wěn)定性測定結(jié)果具有良好的精密度與較好的穩(wěn)定性。 表 2 精密度與穩(wěn)定性試驗 五、 國內(nèi)外標準情況 保健食品中大豆異黃酮的測定方法 高效液相色譜法方法 ： 標準品制備：稱取大豆苷、大豆黃苷和染料木苷、大豆素、大豆黃素和染料木素（純度均為 上）各 4 別置于 10 量瓶中，加入二甲基亞砜至接近刻度，超聲處理 30 用二甲基亞砜定容。各標準儲備液濃度均為 400 ?；旌蠘藴适褂萌芤号渲疲?8.0 混合標準溶液配制：吸取大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素六種標準儲備溶液各0.2 10 量瓶中，加入等體積水，用 50%二甲基亞砜溶液定容。依同樣方法分別配制 16.0 L、 24.0 L、 32.0 、 40.0 的混合標準使用溶液。 樣品處理：固體樣品粉碎、磨細（過 80 目篩）、混勻，半固體樣品混勻，稱取樣品 g 0.5 g（精確至 用 80%甲醇溶液溶解并轉(zhuǎn)移至 50 量瓶中，加入 80%甲醇溶液至接近刻度；液體樣品：吸取混勻液體樣品 0.5 .0 50 量瓶中，加入 80%甲醇溶液至接近刻度。將上述樣品溶液用超聲波振蕩器震蕩 20 80%甲醇定容，搖勻。取樣品溶液置于離心管中，離心機離心 15 速大于 8000 r/取上清液用濾膜（孔徑為 m）過濾，收集濾液備用。 在標準品制備以及試驗樣品處理方面本標準采用的方法相較于保健食品中大豆異黃酮的測定方法 高效液相色譜法的 優(yōu)點在于大豆異黃酮單體標準品使用量較少，可以節(jié)約試驗成本，實驗操作相對簡便 ，樣品處理方法比較統(tǒng)一，檢測結(jié)果更具有對比性。 保健食品中大豆異黃酮的測定方法 高效液相色譜法中色譜條件： 色譜柱： .6 250 度 5 m 不銹鋼色譜柱（也可使用分離效果相當?shù)钠渌讳P鋼柱）； 流動相 A：乙腈（色譜純）； 流動相 B：磷酸水溶液（ ； 柱溫： 30 ； 進樣量： 10 L； 檢測波長： 260 流速： 1.0 mL/ 目前國內(nèi)外與之相關的標準有： oy 001；國內(nèi)的保健食品中大豆異黃酮的測定方法 高效液相色譜法以及糧油檢驗 大豆異黃酮含量測定 高效液相色譜法專門針對保健食品和糧油中異黃酮含量的測定。 3中方法均采用測定 6種標準異黃酮單體的含量來 確定大豆異黃酮的總含量。 本標準的一次測定 12種大豆異黃酮單體的 準確地檢測大豆籽粒及制成品中 各 的異黃酮組分的含量 ，且 各組分濃度與其對應的峰面積具有良好的線性關系（ 該方法使用樣品量較少，檢測異黃酮含量快速、準確，適合大豆原料樣品和 大豆 制 食品的異黃酮含量的 分析檢測。 中國食品工業(yè)協(xié)會豆制品專業(yè)委員會 二零一 七 年 一 月 十一 日