花色素苷生物合成相關基因的研究進展分析研究生物技術專業(yè)

花色素苷生物合成相關基因的研究進展 類黃酮化合物是植物次生代謝產(chǎn)物的一部分。類黃酮化合物可以以單體、二聚體和寡聚體的形式存在，幾乎分布在植物所有的組織中，但主要在液泡中。它們也以有色寡聚/多聚分子混合物的形式存在于各種心材和樹皮中?；ㄉ剀帐穷慄S酮類化合物中最重要的一類化合物?；ㄉ爻Ｒ攒疹愋问酱嬖谟谥参锛毎号葜小；ㄉ剀粘俗鳛榛?、果實和種子的主要色素之外，還有其他多種功能。特異的類黃酮化合物還可以吸收紫外線，使植物免受紫外線B的輻射，從而防止紫外線對植物的傷害（Ebel and Hahlbrock, 1982）；參與調(diào)節(jié)植物對生長素的反應（Jacobs and Rubery, 1988; Harborne and Williams, 2000）；具有類似外激素的功能，吸引昆蟲授粉。現(xiàn)今，人們之所以對花色素苷類化合物產(chǎn)生濃厚的興趣，主要還是因為它給人類的身體健康帶來很大的益處。飲食中的花色素苷類化合物可能對許多疾病具有預防和治療作用。許多研究顯示花色素苷類合物可以預防中風、抑制腫瘤發(fā)育，具有抗炎性，口服花色素苷對糖尿病和潰瘍有好處。花色素苷類化合物作為一類類黃酮，同時也具備類黃酮的一般生理活性。大量研究已證實紅葡萄酒的健康效果（特別是預防心血管疾病）與其所含有的花色苷及其聚合物密不可分。目前市場已出現(xiàn)以花色素苷為主要有效成分的改善視力的功能性或保健食品。不過，要注意的是不同種類的花色素苷的生理功能定位可能會有所不同。總之，花色素苷類化合物作為一類功能性基料，在功能性食品領域具有很好的應用前景（唐傳核，2005）。1 花色素苷的生物合成途徑花色素苷的生物合成（圖1.2）是由丙二酰CoA和香豆酰CoA在查爾酮合成酶（CHS；EC 2.3.1.74）催化下產(chǎn)生查爾酮開始的。其中香豆酰CoA是從苯丙氨酸經(jīng)過多步酶促反應形成的。苯丙氨酸脫氨酶（PAL；EC 4.3.1.5）是這一系列酶反應中的第一個酶。該酶將苯丙氨酸轉化為肉桂酸，將酪氨酸轉化為香豆酸。該合成途徑也是合成其他多種化合物（如類黃酮、木質(zhì)素、芪類化合物和香豆素等）的起始點，因此受到發(fā)育和多種外界環(huán)境因素的調(diào)控。圖1.2 類黃酮的生物合成途徑（趙昶靈等，2003）Fig 1.2 Biosynthetic pathway of flavonoids黃烷酮在黃烷酮-3-羥化酶（F3H；EC 1.14.11.9）的催化下，C環(huán)第三位置羥化而形成二氫黃酮醇。該酶在一般條件下不穩(wěn)定。由F3H催化所生成的二氫黃酮醇，通常是其他兩種酶B環(huán)羥化酶，即二氫黃酮醇3羥化酶（F3H）和二氫黃酮醇35羥化酶（F35H）的底物。由F3H、F3H和F35H三種羥化酶所催化反應的產(chǎn)物是合成花色素苷的直接前體。二氫黃酮醇被羥化的程度和位置不同，將決定最終合成的花色素苷的種類和花的顏色。如果B環(huán)的3和5位置都被羥化，二氫黃酮醇將變成二氫楊梅黃酮，這是藍紫色的翠雀素糖苷的直接前體；如果B環(huán)只有3位置被羥化，將變成二氫櫟皮酮，這是紅色的花青素糖苷的直接前體；如果3和5位置都沒有被羥化，則轉變成磚紅色的花葵素糖苷。圖1.3 類黃酮化合物生物合成途徑中果實中參與花色素和黃酮醇合成的酶類及其大分子復合物模型A. 產(chǎn)生楊梅素和槲皮素，進而生成翠雀素和矢車菊素來源的花花色素苷模型；B. 產(chǎn)生槲皮素，進而產(chǎn)生矢車菊素來源的花色素苷模型；C. 產(chǎn)生山奈素和槲皮素，進而生成天竺葵素和矢車菊素來源的花色素苷模型（Jaakola et al., 2002）。Fig 1.3 Models for the organization of flavonoid pathway enzymes for production of anthocyanidins and flavonols in fruits, supposedly as macromolecular complexes at the endoplasmic reticulum. A, Model for the production of myricetin and quercetin in connection to delphinidin- and cyanidin-derived anthocyanins. B, Model for the production of quercetin in connection with cyanidin-derived anthocyanins. C, Model for the production of kaempferol and quercetin in connection with cyanidin- and pelargonidin-derived anthocyanins (strawberry, raspberry partially).從二氫黃酮醇轉變成花色素苷的反應非常復雜，需要幾個不同酶的作用。其中一些已被證實。由于這個過程的復雜性和中間產(chǎn)物的不穩(wěn)定，精確的反應過程還沒有完全搞清楚。二氫黃酮醇4還原酶（DFR）是將二氫黃酮醇轉變成花色素苷的第一個酶。該反應需要NADPH，其產(chǎn)物是不穩(wěn)定的無色花色素。花色素合成酶（ANS）是一個加雙氧酶，催化從無色花色素到花色素的轉變。這個過程還沒有完全搞清楚，也許需要第二個酶，可能是個脫氫酶的作用（Heller and Ferkmann.,1988）。不穩(wěn)定的花色素形成后，類黃酮葡糖基轉移酶（UFGT；EC 2.4.1.9）進一步催化，促使糖苷化轉變成穩(wěn)定的花色素苷。參與類黃酮化合物生物合成的酶類形成1個多酶復合體，這些復合體以一定的方式排列并催化生物合成途徑中的順序反應，對于細胞而言，活性位點的中間代謝物的直接轉化有利于提高代謝的效率，原因在于代謝途徑中許多分支點上存在對底物的競爭，而中間代謝物極其活躍并具有潛在的毒性，這些化合物的整體濃度很低，對于細胞而言，它需要對內(nèi)外的信號作出快速反應并改變末端產(chǎn)物的種類和數(shù)量（Winkey-Shirley，2001）。Jaakola等（2002）比較完善地描述了這一多酶復合物體系的模型（圖1.3）。2 花色素苷生物合成相關基因花色素苷的生物合成是由許多酶催化完成的。花色素苷合成途徑中幾乎所有的基因包括一些調(diào)節(jié)基因（如玉米的R和C1）均已分離。這些基因可以分成兩類，第一類是不同植物種類共同具有的結構基因，第二類是調(diào)控結構基因活性、色素空間和時間積累的調(diào)節(jié)基因。目前采用轉座子標簽、PCR擴增與異源雜交、差異cDNA克隆和遺傳篩選相結合的方法及實驗手段，分別在玉米、金魚草和矮牽牛等材料中分離克隆到與花色素苷生物合成過程相關的關鍵酶基因。2.1 結構基因結構基因是指不同植物共同具有的直接編碼花色素代謝的生物合成酶的基因。利用轉座子標簽、PCR擴增、差異雜交、cDNA克隆等方法，已分別在玉米、矮牽牛、金魚草等大部分植物中克隆出了多個與花色素苷生物合成相關的結構基因，如CHS、CHI、F3H、F3H、F35H、DFR、ANS以及3GT基因等（表1.3）。表1.3花色素苷生物合成相關結構基因Table 1.3 Structural genes of anthocyanin biosynthesis基因Gene來源Taxon登錄號Accession Number基因長度（bp）Sequence LengthPALArabidopsis thalianaAY0929572414Zea maysNM_0011118642488Ipomoea nilAF3254965172Gerbera hybridZ38099244Vitis viniferaDQ887093668Oryza sativaEF576230445CHSA. thalianaNM_1213961491Z. maysX602053829I. purpureaU159461835Antirrhinum majusX037103574Chrysanthemum ×morifoliumDQ5212721416V. viniferaEF1924641182O. sativaX898591606CHIA. thalianaNM_126020696Z. maysZ227602278I. purpureaAF028238912A. majusM68326667ChrysanthemumEF094934720V. viniferaX75963979O. sativaNM_001072119890F3HA. thalianaAK2271521362I. purpureaAB1132621877A. majusDQ2725921981ChrysanthemumEU286276580V. viniferaDQ7866321887O. sativaNM_0010708731863DFRA. thalianaNM_1236451358Z. maysX050684467I. purpureaAF0286011306A. majusX155361608ChrysanthemumEF0949351143V. viniferaY117491250O. sativaAB0034961480ANSA. thalianaAY0865391269Z. maysX553142837I. purpureaAF0286021376V. viniferaEF1924681144O. sativaY079551606UF3GTA. thalianaNM_1247851491Z. maysX135021594I. purpureaAF0282371494V. viniferaAB0470971925PAL是苯丙烷類化合物途徑（也可能是所有次生代謝物代謝途徑）中研究得最詳盡的酶。在某些植物中，PAL似乎只由一個基因編碼，而在另一些植物中，則是由1個多基因家族編碼。菜豆的基因組里面包含了3個PAL基因（Cramer et al.,1989）。Boss等（1996）認為在葡萄組織中雖然只有果皮合成花青苷，但PAL基因在大多數(shù)器官中均能表達。這說明PAL所催化的反應并不僅為花青苷合成提供前體，也為其他物質(zhì)提供前體（李興國等，2003）。在這個多基因家族中，不同成員的表達特異性不同。PAL多基因家族成員在表達上的差異是由于它們啟動子所包含的cis-elements不同所引起的。正是由于這些cis-elements和相應的轉錄因子的共同作用，使得不同的PAL基因能在不同時間和不同組織里表達。例如，一個只在花里表達的Myb類轉錄因子與gPAL2啟動子的P-box結合后能活化具有花組織特異性（Sablowski, 1994）。CHS酶基因首先是從歐芹屬Petroselium hortense中分離出來的（Krenzaler et al., 1979; Harashima et al., 2003; Huang et al., 2004）。很多物種的CHS基因有較高的核苷酸相似性，已構建的CHS基因系統(tǒng)樹表明他們可能有共同的起源（Niesbach-Klõsgen et al., 1987; Yang et al., 2002；Huang et al., 2004）。功能上的相似性表明它們可能來自于脂肪酸合酶超基因家族（Koes et al., 1993）。CHS基因家族的進化歷程也是一個基因重復的過程。牽牛的CHS基因在所有已克隆到的CHS基因中進化速率較快（Durbin et al., 1995; Yang et al., 2004）。最早進行花色改良的研究就是選擇CHS基因作為調(diào)控對象。對CHS的反義調(diào)控使花色素合成被打斷而使花色變淡，甚至變成白色或者粉色（白新祥和戴思蘭，2005）。CHI基因已分別在豌豆、矮牽牛、苜蓿、翠菊、橙等多種植物中被克隆出來。在菜豆的基因組里，只有1個CHI基因（Mehdy and Lamb,1987），其表達能被真菌侵染和機械損傷誘導。在矮牽牛的基因組里由兩個CHI基因（A和B）（van Tunen et al., 1988,1989）。CHI-A基因在花組織和經(jīng)紫外照射的幼苗（或實生苗）里表達。而CHI-B基因僅在未成熟的花粉中表達。另外，CHI-A基因的表達與CHS-A和J基因的表達相協(xié)調(diào)，具有相似的器官和細胞表達特異性。F3H已在多種植物如金魚草、石竹和馬鞭草等的花提取液里發(fā)現(xiàn)。F3H突變會促使花中積累花葵素而非花青素，致使花呈現(xiàn)橙或紅色（孟繁靜，2000）。目前研究集中于通過把F35H轉入一些花卉中以期得到藍色花（Fukui et al., 2003），而針對F3H基因的研究相對較少。但從花色素的合成途徑上來看，把正義基因和反義基因結合起來將具有廣闊的應用前景，如通過抑制F3H基因的表達使其產(chǎn)生天竺葵素，創(chuàng)造出新穎的紅色花（于曉南和張啟翔，2002）。白新祥和戴思蘭（2005）也提出可以在轉入F35H基因的基礎上，再用反義技術對F3H基因進行抑制，從而使花色素合成途徑朝飛燕草色素糖苷方向發(fā)展。DFR是花色素苷生物合成下游途徑的第一個關鍵酶。DFR的主要功能是使二氫黃酮醇（DHK、DHQ和DHM）還原為無色花青苷元（leucoanthocyanidins），屬于DFR超家族（Forkmann and Ruhnau，1987；Martens et al., 2002; 劉娟等，2005）。利用蛋白質(zhì)純化、轉座子標簽、PCR及鑒別篩選等手段已從擬南芥、玉米、金魚草、非洲菊、玫瑰、康乃馨等眾多植物中眾多植物中克隆到DFR基因（包滿珠，1997；OReilly，1985；Beld等，1989；Aida等，2000；Krol，1990；Nakatsuka et al., 2003）。ANS的作用是將無色花色素苷元氧化，產(chǎn)生有顏色的花色素苷元，對花色素苷的合成起到關鍵作用(圖1.6)（Saito et al., 1999; Springob et al., 2003）。已經(jīng)從眾多植物中克隆到ANS基因。ANS基因可能屬于類似于黃烷酮3羥化酶（F3H）和黃酮醇合成酶（FLS）的2-酮戊二酸加氧酶家族(Springob et al., 2003)。UFGT是花色素苷生物合成過程中的最后一個酶基因，它主要是促使不穩(wěn)定的花色素轉變?yōu)榉€(wěn)定的苷類物質(zhì)。Kobayashi等（2002）在紅色葡萄中檢測到UFGT基因的表達，并且通過基因序列分析指出，表現(xiàn)型由白色向紅色的轉變，是控制UFGT基因表達的調(diào)節(jié)基因作用的結果。所以UFGT基因的表達在葡萄花色素苷生物合成中具有決定性的作用（李興國等，2003）。2.2 調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因是指能夠影響結構基因的表達方式和表達強度的基因，花色素苷生物合成的每一步酶促反應均是調(diào)節(jié)基因作用的靶位點。除了結構基因外，至少還有3類調(diào)控基因在調(diào)節(jié)花色素苷代謝途徑的表達，包括MYB基因家族、基本的螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）類型轉錄因子和WD40重復蛋白（表1.4；Springob et al., 2003；黃金霞等，2006）。這些基因調(diào)節(jié)著生物合成酶活性、色素積累基因時空表達。這些轉錄因子通過與結構基因啟動子中含有的能被其識別的順式作用元件結合，從而激活花色素苷生物合成途徑中多個基因的表達，有效啟動花色素苷生物合成途徑。此外，這些轉錄因子多數(shù)還具有多效性，不僅調(diào)控花色素苷的生物合成，同時也參與調(diào)節(jié)其他的生理過程（吳江等，2006）。表1.4 幾種植物中調(diào)控花色素苷生物合成的轉錄因子Table 1.4 Anthocyanin-regulated transcriptional factors 利用轉座子標簽技術現(xiàn)已分離出2類花色素苷調(diào)節(jié)基因，一類是MYC型轉錄因子，如玉米的R基因家族（R、S、Sn、Lc基因）和金魚草Delila基因；另一類是MYB型轉錄因子，如玉米的C1、P1、P、Vp1基因。bHLH類調(diào)控因子的調(diào)控目標與MYB類一樣較為廣泛，除了類黃酮合成途徑外（Hartmann et al., 2005），也參與調(diào)控與之無關的途徑（Spelt et al., 2002）。其中R/B基因家族編碼的蛋白的部分序列與MYC原癌蛋白以及哺乳動物的MYC轉錄因子的堿性亮氨酸拉鏈（bHLH DNA）結合域具有同源性（葛靜等，2006）。因此部分學者也認為MYC即為bHLH類型的轉錄調(diào)節(jié)因子（吳江等，2006）。此外，R/B基因家族編碼的蛋白都具有相同的功能，但有不同的組織表達特異性，即可決定種子和植物體中不同部位的色素形成（葛靜等，2006）。矮牽?；ㄖ兄辽儆?個調(diào)控基因控制花器官中花色素苷合成結構基因的轉錄，其中an1含有bHLH結構域，其除了調(diào)節(jié)花色素苷的生物合成外，還在花瓣細胞液泡的酸化和種皮的上表皮形態(tài)建成中起著重要的作用（Spelt et al., 2002）。此外Goodrich等（1992）從金魚草中克隆到的Delila基因編碼的蛋白也含有bHLH結構。WD40重復蛋白在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用中擔當了重要作用。Pattanaik等（2006）證實bHLH轉錄因子Delila可以提高擬南芥CHS基因啟動子的活性。WD40蛋白能夠調(diào)控葉毛形成和色素合成的信號轉導途徑，與其他色素調(diào)控子相比，WD40蛋白的保守性更強（葛靜等，2006）。但這些調(diào)控因此如何控制結構基因表達的細節(jié)仍有待進一步的研究。隨著研究的深入，逐漸明確了其他與花色形成有關的基因功能，并克隆了部分基因，如從矮牽牛中克隆到7個與pH值有關的基因（pH1-pH7）。這7個基因控制矮牽牛花瓣細胞液的pH值，從而影響花色，其中pH1、pH2和pH6專一影響液泡的pH值（Vlaming et al., 1983；Griesbach,1998）。通過對這些基因位點的反義抑制，就有可能達到提高液泡pH，這對藍紫色花系的育種將會有很大的幫助（白新祥和戴思蘭，2005）。3 花色素苷合成相關基因的表達調(diào)控高等植物花色素苷生物合成由多步酶促反應完成，每一步酶促反應均是調(diào)控基因作用的靶位點。花色素苷生物合成系統(tǒng)是研究基因表達和調(diào)控的最佳系統(tǒng)之一?；ㄉ剀丈锖铣山Y構基因和調(diào)控基因表達的改變，引起表型改變最終在花的顏色上反映出來。轉錄調(diào)節(jié)是植物花色素苷生物合成途徑中調(diào)節(jié)其結構基因表達的重要環(huán)節(jié)之一。這些轉錄因子單獨或協(xié)作作用調(diào)節(jié)花色素苷合成途徑中結構基因的表達，從而控制植物體內(nèi)花色素苷的合成。通過結構基因酶活性或mRNA表達分析可詳細了解帶有不同調(diào)控基因位點的植物的調(diào)節(jié)作用部位。越桔果實成熟過程中果實花色素苷、原花色素及其它類黃酮化合物的積累與花色素苷合成相關基因的表達水平一致（Jaakola et al.，2002）。在角堇發(fā)育過程中ANS基因是調(diào)控花色變化的關鍵酶基因之一（Farzad et al.，2002）。CHS與DFR基因由于在蕾期就已激活，因此在角堇個體發(fā)育過程中這兩個基因均表達，且DFR基因在花發(fā)育過程中向上調(diào)節(jié)花色素苷合成的早期生物合成基因（Farzad et al.，2003）。不同種類植物轉錄因子調(diào)節(jié)花色素苷生物合成的作用位點不同。在玉米上，大約有20個調(diào)控基因影響花色素苷產(chǎn)生，其中6個調(diào)控基因（R、B、C1、P1、P和Vp1）依照其影響結構基因酶活性和mRNA水平而了解其調(diào)控功能。其中除P和Vp1的基因外，它們的調(diào)控作用對3-羥基花色素苷具有高度的特異性。R/B基因對CHS、DFR等基因的表達都是必須的，可以在單子葉和雙子葉植物中調(diào)控花色素苷的生物合成。由P基因編碼的MYB轉錄因子其結構域與黃烷酮醇還原酶或DFR啟動子A1結合調(diào)控玉米仁中3-脫氧類黃酮和韌皮部色素的合成，這一過程不需要bHLH結構的轉錄因子協(xié)同作用（Sainz et al., 1997）。Vpl對種子的休眠具有多效性和較普遍的作用。轉錄因子調(diào)控花色素苷生物合成途徑CHS與下游DFR、3GT等酶編碼基因的表達。在矮牽牛中，R/B基因家族中的Lc基因對DFR、F35H、ANS、UFGT等基因的激活作用較強，對CHS、CHI和F3H的激活相對較弱，PAL則不受Lc影響（Bradley et al., 1998）。an1是DFR以及其他花色素苷結構基因組織特異表達的決定性因素（Spelt et al., 2002）。金魚草AmMYB305、AmMYB340基因的調(diào)控表達與玉米中P基因相似，不依賴于bHLH結構的轉錄因子，調(diào)控生物合成途徑F3H與下游DFR、ANS、3GT等酶編碼基因的表達（Moyano et al., 1996）。歐亞種葡萄上MYB結構域轉錄因子通過調(diào)控生物合成途徑之后期階段UFGT基因的轉錄表達參與花色素苷生物合成的調(diào)節(jié)（Kobayashi et al., 2002）；番茄上MYB結構域轉錄因子則是通過調(diào)控生物合成途徑之前期階段CHS與后期階段DRF基因的轉錄表達參與花色素苷生物合成的調(diào)節(jié)（Mathews et al., 2003）?；ㄉ剀盏纳锖铣筛饕氖峭ㄟ^轉錄因子間的協(xié)作而進行的。由于擬南芥基因組小、冗余性低等特點，有關花色素苷合成的研究較深入，大多數(shù)與色素合成有關的突變體都得到了分離與鑒定。如轉錄因子TTG2、TT1與TTG1、TT2、TT8一起控制著擬南芥中原花色素的合成；TT2基因編碼的MYB蛋白激活后期色素代謝途徑，依賴bHLH型轉錄因子TT8的作用，協(xié)作控制DFR和BAN基因的時空表達（Nesi et al., 2000，2001）。在玉米上，MYB型轉錄因子C1P1和 bHLH型轉錄因子RB協(xié)同誘導花色素苷生物合成途徑結構基因的表達（Springob et al., 2003）。Selinger等（1999）研究還表明轉錄因子BC1和P激活花色素苷生物合成結構基因的表達需要PAC1的參與。在矮牽牛上，色素的生物合成途徑至少受到2個轉錄因子的調(diào)節(jié)（Quattrocchio et al., 1993），轉錄因子蛋白質(zhì)的相互作用對控制花色素苷生物合成結構基因的表達是必需的。除植物內(nèi)部的發(fā)育信號外，花色素苷的合成過程還受到環(huán)境信號因子的調(diào)控?；ㄉ剀盏纳锖铣蛇^程通過這些信號間的復雜互作來實現(xiàn)。現(xiàn)已證實，赤霉素（GA3）、光和糖等信號因子在誘導花色素苷生物合成中也有重要的作用（許智宏，1998）。