【基金標書】2010CB529700-炎癥過程中細胞間相互作用的信號轉(zhuǎn)導機制及其應用研究

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項目名稱： 炎癥過程中細胞間相互作用的信號轉(zhuǎn)導機制及其應用研究首席科學家： 耿建國 中國科學院上海生命科學研究院起止年限： 2010 年 1 月-2014 年 8 月依托部門： 中國科學院 上海市科委一、研究內(nèi)容本項目將針對炎癥過程中細胞的識別、黏附、極性形成、遷移和效應等細胞間相互作用的不同步驟，分 別有側(cè)重的展開深入研究，發(fā)現(xiàn)新的信號調(diào)控分子和揭示新的信號轉(zhuǎn)導機制，并 進一步對細胞參與炎癥反應的整個過程進行綜合分析和整體把握，加深我們對 炎癥反應過程本質(zhì)的系統(tǒng)認知。主要研究內(nèi)容包括以下幾方面：1．揭示調(diào)控炎癥細胞識別炎癥信號與其它細胞或胞外基質(zhì)發(fā)生黏附，形成極性并響應炎癥信號發(fā)生遷移，以及最終發(fā)揮生物學效應的信號轉(zhuǎn)導機制：從分子生物學、表觀遺傳學、生物化學和細胞生物學等角度，利用基因 轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控、生物化學分析和細胞活性檢測等方面的現(xiàn)代生物學研究手段，深入探討TLR 等膜受體、整合素等細胞黏附分子、 Par 復合物等 細胞極性分子、Src 激酶等細胞內(nèi)信號調(diào)節(jié)分子、NF- ?B 等關鍵轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白等表觀遺傳調(diào)控蛋白、IL-1?等細胞因子、MMP 等基質(zhì)蛋白酶類以及 SAP 等細胞分泌蛋白等，對炎癥過程中細胞的識別、黏附、極性形成、遷移和效應等細胞間相互作用進行精確調(diào)控的分子機制和關鍵因子。2. 解析炎癥過程中細胞間相互作用的信號轉(zhuǎn)導在炎癥相關重大疾病發(fā)生發(fā)展中的生物學功能：利用基因工程小鼠技術和小動物炎癥模型，建立與發(fā)展基于炎癥中細胞間相互作用的重大疾病研究模型與系統(tǒng)，深入研究上述發(fā)現(xiàn)的新的信號轉(zhuǎn)導分子、調(diào)節(jié)分子和信號途徑間的交互作用與惡性腫瘤、心腦血管疾病、哮喘、類風濕性關節(jié)炎和全身炎癥反應綜合征等重大疾病發(fā)生發(fā)展的關系以及可能存在的致病機理。結合本項目團隊中來自醫(yī)科大學的成員所擁有的臨床資源，在病人樣品和實例中確認所發(fā)現(xiàn)的炎癥調(diào)控信號轉(zhuǎn)導機制，對若干重大疾病的機理提出重要見解，并提供潛在的診治靶點。3. 發(fā)現(xiàn)新的抗炎藥物作用靶點，利用相應的藥靶篩選系統(tǒng)進行主要基于小分子化合物規(guī)?；Y選的抗炎藥物研發(fā)：爭取發(fā)現(xiàn)針對炎癥相關重大疾病的新的抗炎藥物作用靶點，并建立有效的篩選系統(tǒng)，利用商 業(yè)化合物庫和已建立的小分子化合物庫，進行針對候選靶點的小分子化合物活性篩選。根據(jù)活性化合物的結構，進行合理藥物設計和結構多樣性的合成，通過數(shù)輪的結構優(yōu)化和全面的構效關系分析，獲得先導化合物。根據(jù)構效關系， 對活性化合物 進行選擇性的分子標記（如生物素標記和熒光標記等），用作生物學研究的工具分子。同時積極開展活性先導化合物的體內(nèi)抗炎活性評價。4. 建立和完善炎癥研究領域的技術和生物學分析體系：在以上系統(tǒng)深入的研究過程中，依靠科技進步和技術創(chuàng)新，不斷完善炎癥中細胞間相互作用的研究技術和策略，建立更高效更合理的炎癥領域研究系統(tǒng)和分析體系。二、預期目標（一）總體目標本項目將圍繞炎癥及其相關重大疾病中細胞的識別、黏附、極性形成、遷移和效應等方面，系統(tǒng)研究炎癥 過程中的細胞間相互作用，闡釋炎癥細胞及其所處環(huán)境間相互作用的信號轉(zhuǎn)導機制和調(diào)控規(guī)律，探討炎癥細胞參與重大疾病發(fā)生發(fā)展的生物學基礎，鑒定一系列調(diào)控炎癥反應的關鍵蛋白，為炎癥相關疾病的診治提供具有自主知識產(chǎn)權的策略和手段。通過本項目的實施，獲得一系列國際領先的研究成果，打造一支達到國際先進水平的炎癥研究隊伍，使我國的炎癥相關基礎研究和應用研究躋身于國際先進行列。（二）五年預期目標1. 在基礎理論研究方面：（1（ 從分子、細胞到動物整體水平，發(fā)現(xiàn)并確認多種調(diào)控炎癥過程中細胞間相互作用的新的關鍵調(diào)控因子和信號途徑，闡明這些新的分子調(diào)控機理在炎癥細胞的識別、黏附、極性形成、遷移和效應等過程中的生理功能。（2（ 解析上述調(diào)控炎癥過程中細胞間相互作用的信號轉(zhuǎn)導機制在惡性腫瘤、心腦血管疾病、哮喘、類風濕性關節(jié)炎和全身炎癥反應綜合征等重大疾病發(fā)生發(fā)展中的分子病理學機制。（3（ 建立和完善炎癥研究領域的技術和生物學分析體系，形成 1－2 種新技術方法和本領域的前沿性研究體系。2. 在應用基礎研究方面：通過發(fā)現(xiàn)和揭示與重大疾病相關的調(diào)控炎癥細胞間相互作用的新分子、新功能和新機制，確定有效的抗炎新通路或新靶標，建立快速可靠的活性化合物篩選模型。通過通量篩選、合理藥物設計、多 樣性合成、和結構優(yōu)化，獲得 10 個以上有效的抗炎活性先導化合物，完成較全面的構效關系研究，并期望獲得 2 個以上具有顯著抗炎效果的藥物候選化合物。3. 成果考核指標：努力在國際相關研究領域做出具有重要影響的工作，在國際一流雜志（IF>10）發(fā)表 10 篇以上論文，在有影響力的雜志（IF>5）上發(fā)表 50 篇以上論文，申請 10 項以上相關專利。4. 人才培養(yǎng)：培養(yǎng)博士研究生 50－80 人，國家杰出青年等高級人才 1－3 名。三、研究方案（一）總體研究思路炎癥反應的發(fā)生從本質(zhì)上講就是各種炎癥細胞在致炎/抗炎因子等作用下，通過不同的信號轉(zhuǎn)導機制發(fā)生相互作用的過程，包括了從炎癥細胞識別炎癥信號與其它細胞或胞外基質(zhì)發(fā)生黏附，到炎癥細胞形成極性并響應炎癥信號發(fā)生遷移，以及最終炎癥細胞發(fā)揮生物學效應的整個過程，既有明確的階段和步驟，又是相互間在時空上密切聯(lián)系、有機統(tǒng)一的完整過程。整個過程可分為細胞的識別、黏附、極性形成、遷移和效應等不同步驟，而其中每一步驟都受到精細的信號調(diào)控，各種信號轉(zhuǎn)導機制是調(diào)控細胞生命活動的基礎。本項目將針對上述炎癥過程中細胞間相互作用的每一步驟分設課題，分別展開深入的信號轉(zhuǎn)導機制研究，以期能在整個項目層面上對整個炎癥反應過程有一個系統(tǒng)綜合的認知。只有在對炎癥過程中調(diào)控細胞生命活動的信號轉(zhuǎn)導機制進行充分認知的基礎上，才能深入了解細胞生命活動在炎癥相關重大疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，有效確定治療炎癥的藥物作用靶點，并 進行相應的藥物篩選和開發(fā)，為炎癥及其相關重大疾病的診療提供新的策略和手段，提高人民群眾健康生活質(zhì)量。（二）技術路線本項目將針對炎癥過程中細胞的識別、黏附、極性形成、遷移和效應等細胞間相互作用的不同步驟，分 別有側(cè)重的展開集中深入的研究，設置了相應的六個研究課題，包括：1、炎癥過程中細胞識別的信號轉(zhuǎn)導 機制；2、炎癥 過程中細胞黏附的信號轉(zhuǎn)導機制；3、炎癥 過程中細胞極性形成的信號轉(zhuǎn)導機制；4、炎癥過程中細胞遷移的信號轉(zhuǎn)導機制；5、炎癥過程中細胞效應的信號轉(zhuǎn)導機制；6、抗炎活性化合物篩選及優(yōu)化。以下根據(jù)各個課題的具體情況分別進行介紹：總體技術途徑示意圖（三）可行性1. 本研究項目的總體研究方案切實可行從學術思路上看，本項目以炎癥中細胞間相互作用為主線，以細胞間發(fā)生相互作用基本過程中調(diào)控各個步驟的信號轉(zhuǎn)導機制為對象，并在前述基礎研究的引導下進行抗炎藥物的研發(fā)。 六個研究方向彼此間時空有序、相互補充、有機 結合，綜合研究了炎癥過程中 細胞間相互作用的各個層面，密切合作、互 為指導，避免了單獨某個方向或?qū)用嫜芯康木窒扌?，為實質(zhì)性推進炎癥及其相關重大疾病的治療奠定了基礎。從技術途徑上看，本項目是在已有工作基礎上的拓展和深入，研究內(nèi)容是在各參與研究組工作基礎上提出的具有原創(chuàng)性的內(nèi)容，前期的工作都已取得了國際水平的進展，具有扎實 的工作基礎。相關的 實驗 方案合理可行， 實驗方法成熟，必需的實驗技術也已掌握，在技術上是完全可行的。各學術骨干均有獨特的技術專長，涵蓋生物化學、分子生物學、細胞生物學、免疫學、藥學、有機化學和基礎醫(yī)學等學科，優(yōu)勢互補 ，便于 聯(lián)合攻關。六個具體研究課題的技術途徑和路線清晰明確，切實可行。2. 本研究項目凝聚了優(yōu)秀的研究團隊本項目有高級職稱人員 26 名，其他研究技術人員 41 名，平均年齡約為 35歲。研究 隊伍包括“國家杰出青年基金”獲得者 5 名、中科院“百人計劃” 入選者 8名。本項 目凝聚的優(yōu)秀研究 團隊，確保了本 項目切實 可行。研究團隊成員已經(jīng)承擔過多項本研究項目相關項目，其中包括國家重大科學研究計劃（首席科學家 2 名）、科技部“973”項目（首席科學家 1 名、課題負責人3 名）、科技部“863”項目、國家自然科學基金重點項目、國家杰出青年基金等，具有相關國家級重大/重點項目順利實施的豐富經(jīng)驗。3. 扎實的工作基礎確保了本研究項目順利實施本研究團隊在炎癥領域基礎研究和應用研究方面有非常扎實的研究基礎，近 5 年來， 項目組成員已經(jīng) 作為通訊作者/第一作者 在《Cell》、 《Nature》和《Science》及其子刊上發(fā)表 論文 7 篇，影響因子大于 10 分的共有 14 篇，影響因子大于 5 分的共有 49 篇。此外 還有大量藥物化學和應用研究方面的成果。4. 良好的工作條件和環(huán)境為本研究項目順利完成提供了保障本項目依托、承擔和參加研究單位（中國科學院上海生命科學研究院、南方醫(yī)科大學、中國人民解放軍 第二軍醫(yī)大學、中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學等）都屬于國內(nèi)一流的科研院校，有很強的綜合科研實力。并且大部分科研骨干都依托于多個國家級和省部級重點實驗室，包括醫(yī)學免疫學國家重點實驗室、腫瘤生物學國家重點實驗室、分子生物學國家重點實驗室、生命有機化學國家重點實驗室、中國科學院分子細胞生物學重點實驗室、中國科學院再生生物學重點實驗室、中國科學院營養(yǎng)與代謝重點實驗室、再生醫(yī)學教育部重點實驗室和重大疾病的轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組學教育部重點實驗室。這些國內(nèi)一流的科研院校及所依托的國家級和省部級重點實驗室為本項目大開展提供了良好的工作環(huán)境和條件。本項目依托、承擔和參加研究單位裝備了開展生物化學、分子生物學、 細胞生物學、蛋白質(zhì)組學、結構生物學、 藥學、有機化學、免疫學、基礎和臨床醫(yī)學等學科方面研究的儀器設備，如共聚焦顯微鏡、 實時熒 光定量 PCR 儀、HPLC 儀器、ProteomoX 質(zhì)譜、核磁共振 儀、 紅外光譜儀、元素分析儀、X－衍射儀、旋光儀、氣相色譜儀、毛細管電泳儀、計算機工作站、流式 細胞分析和分 選儀、BIAcore、透射電子顯微鏡、活細胞工作站、Affymetrix 基因芯片平臺、原子力顯微鏡、共聚焦顯微鏡、 實時熒光定量 PCR 儀、HPLC 儀器、4800 MALDI-TOF-TOF 質(zhì)譜、SPR陣列檢測儀、透射電子顯微 鏡、活 細胞工作站等先進 的大型專業(yè)儀器設備。建立了成熟的實驗方法，包括免疫 熒光組織化學技術、激光共聚焦顯微鏡術、包埋前 /后免疫電鏡技術、活細胞成像技術、流式 細胞分析技 術、分子原位 雜交技術、酵母雙雜交系統(tǒng)、免疫共沉淀技 術、 動物模型制備、蛋白 質(zhì)肽譜分析、全基因組掃描和連鎖分析、轉(zhuǎn)基因動物制 備和基因敲除技術、 實驗動物平臺等。 這些條件都確保了本項目在儀器設備和技術方法的需求方面切實可行。（四）創(chuàng)新點與特色本項目是在項目組成員已取得的扎實的炎癥領域科研成果基礎上，以炎癥中細胞間相互作用為主線，以 細胞間發(fā)生相互作用基本過程中調(diào)控各個步驟的信號轉(zhuǎn)導機制為對象，并在前述基礎研究的引導下進行抗炎藥物的研發(fā)，彼此間相互補充、有機結合，對炎癥的發(fā)生發(fā)展展開集中深入的研究。六個研究方向有機整合，綜合研究了炎癥過 程中細胞間相互作用的各個層面，無疑將極大地加深我們對炎癥及其相關重大疾病發(fā)生發(fā)展的分子調(diào)控機制的了解，從而有力推動相應的藥物研發(fā)和臨床診療。 選取炎癥反應中最基本的細胞間相互作用這一特征，對炎癥及其相關重大疾病的發(fā)生發(fā)展進行重點突出、集中深入的研究，并且基礎研究和應用研究緊密結合、相互促進， 這在學術思路上具有良好創(chuàng)新性和重要科學價值。同時，我們將從分子水平、 細胞水平到 動物模型等多個層面揭示各種信號分子在炎癥發(fā)生發(fā)展過程中的關鍵作用，在理論上和技術上均有突出的創(chuàng)新性和特色。理論創(chuàng)新：對國際前沿科學問題的把握和提煉保證了本項目的創(chuàng)新性，我們將針對炎癥細胞及其所處環(huán)境間相互作用的信號網(wǎng)絡和時空動態(tài)調(diào)控規(guī)律展開研究。我 們將從炎癥因子與 I 型干擾素的差異性調(diào)節(jié)這一特殊的視角研究 TLR介導的細胞識別的信號轉(zhuǎn)導機制，提出“炎癥和 I 型干 擾素反應失衡促進炎癥損傷”的理論觀 點，為炎癥性疾病的治療提供新思路。我們創(chuàng)新性地提出 FPR2 在識別 A?、激活小膠質(zhì)細胞及 AD 病理變化中的作用，為 AD 的病理機制提供新的內(nèi)容，為 AD 預防和治療的研究提供新的思路和靶標。選凝素活化整合素的信號通路是我們原創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)，將 對其展開深入揭示。我們擬開展的急性期蛋白對選凝素黏附活性的詳細調(diào)控機制更是從未見報道。我們將從系統(tǒng)生物學的角度研究炎癥過程中細胞遷移的信號調(diào)節(jié)機制。從調(diào)控關鍵轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)結構、miRNA 的關 鍵信號通路和方式等角度揭示炎癥復合體、轉(zhuǎn)錄復合物等生物大分子網(wǎng)絡在炎癥狀態(tài)下對炎癥信號轉(zhuǎn)導的貢獻及規(guī)律。我們也將創(chuàng)新性地開展組蛋白去甲基化酶與炎癥效應的關系、miRNA 對炎癥因子基因表達和炎癥復合體在炎癥因子釋放中的作用方面的研究。技術創(chuàng)新：多種新的技術手段綜合運用是本項目的一大特色。將結構基因組的模式運用于少數(shù)重要的核心蛋白質(zhì)及其復合物，進行集中式高通量的目標片斷優(yōu)化設計，從而高效快速的 獲取靶蛋白及其復合物的結構信息，以高分辨率結構信息為切入點，從分子水平上闡釋炎癥反應過程中細胞識別的內(nèi)部機理。建立了從基因蛋白水平、組織細 胞水平以及動物模型水平的多層次多手段的炎癥相關細胞黏附行為研究系統(tǒng)， 為相關研究的系統(tǒng)深入的開展打下了基礎。將傳統(tǒng)的分子生物學、生物化學、細胞生物學、 結構生物學與 單分子納米技術相結合，研究炎癥反應中的細胞極性這一重大生物學問題。本研究涉及組蛋白甲基化對染色質(zhì)結構的影響、細胞內(nèi)炎癥復合體形成等研究，因此將充分利用分子細胞內(nèi)活體示蹤、熒光偏振能量轉(zhuǎn)移等方法，爭取在蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)-DNA 等大分子復合物研究技術上有所創(chuàng)新。同時，我 們已擁有相當規(guī)模的小分子化合物庫，對活性小分子的化學合成和結構改造也已有多年的研究經(jīng)驗積累，有望開發(fā)出新的合成技術和獲得新穎分子結構。（五）課題設置：課題一 炎癥過程中細胞識別的信號轉(zhuǎn)導機制：研究目標：揭示雙特異性蛋白磷酸酶、Ets 家族轉(zhuǎn)錄 因子以及自主發(fā)現(xiàn)的 DPK 等分子對 TLR 介導的細胞識別信號轉(zhuǎn)導的調(diào)節(jié)作用及其分子機制，解析相關重要蛋白質(zhì)及其復合物的高分辨率晶體結構。明確 FPR2 在識別A?、介導 A?所致 AD 腦部炎癥反 應中的作用及其分子機制，闡明去甲腎上腺素對小膠質(zhì)細胞識別、吞噬和清除 A?的影響及分子機制。研究內(nèi)容：TLR 介導的細胞識別導致促炎癥細胞因子、I 型干擾素、趨化因子的產(chǎn)生，其信號轉(zhuǎn)導對介導炎癥反應的發(fā)生起關鍵作用。本課題將研究雙特異性蛋白磷酸酶 DUSP、Ets 家族轉(zhuǎn)錄因子以及 DPK 等分子對 TLR 介導的細胞識別信號轉(zhuǎn)導的調(diào)節(jié)作用。觀察 DUSP、Ets、DPK 等分子表達缺失在體內(nèi)外對 TLR 活化介導的促炎癥細胞因子、I 型干擾素、 趨化因子表達以及炎癥 細胞趨化效應的影響，研究 DUSP、Ets、DPK 等分子 對已知 TLR 信號轉(zhuǎn)導 分子活化的調(diào)節(jié)作用及其分子間的相互作用，解析重要蛋白質(zhì)分子及其復合物的高分辨率晶體結構，闡明其分子間的相互作用的結構基礎。在阿爾茨海默氏病（AD），?淀粉樣蛋白（A? ）通過激活小膠質(zhì)細胞釋放炎性介質(zhì)而導致神經(jīng)元死亡、突觸功能障礙。小膠質(zhì)細胞 則可吞噬、降解 A?。另外，藍斑神經(jīng)元變性導致其投射區(qū)域去甲腎上腺素（NE）水平的降低加重 AD 的病理變化。本課題擬利用 RNA 干擾技術和基因敲除技術在離體和整體水平進一步研究小膠質(zhì)細胞 A?受體 FPR2 在識別 A?、介 導 A?所致 AD 腦部炎癥反應及病理變化中的作用及其信號轉(zhuǎn)導機制；以及去甲腎上腺素對小膠質(zhì)細胞識別、吞噬和清除 A?的影響及其信號轉(zhuǎn)導機制。為 AD 病理機制及治 療研究提供新的內(nèi)容和靶標。承擔單位：中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學課題負責人： 安華章，教授，中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學主要學術骨干：周兆才，研究員，中國科學院上海生命科學研究院樂穎影，研究員，中國科學院上海生命科學研究院經(jīng)費比例： 16％課題二 炎癥過程中細胞黏附的信號轉(zhuǎn)導機制：研究目標：進一步揭示選凝素活化整合素的信號調(diào)控機制，確認此信號通路中Jak 激酶、Src 激酶、 RhoA 等關鍵分子的活性 調(diào)節(jié)方式。闡明選凝素與急性期蛋白 SAP 和 CRP 的相互作用機理，加深對細 胞黏附分子通過信號轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)炎癥細胞黏附行為的認識。研究內(nèi)容：本課題將研究 P-選凝素活化整合素通路中整合素活性 調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導機制以及此信號通路的負反饋調(diào)控機制，并研究急性期蛋白通過調(diào)節(jié)選凝素活性影響白細胞黏附的信號轉(zhuǎn)導機制。利用我們建立的涉及分子、細胞和動物模型等多層次的炎癥相關細胞黏附行為研究系統(tǒng)，研究 P-選凝素動態(tài)調(diào)節(jié)整合素活化構像的變化以及與其配基的結合；研究 RhoA 對 P-選凝素活化整合素信號通路的調(diào)控，對白細胞和血管內(nèi)皮細胞之間相互作用的影響；利用 PSGL-1 的胞內(nèi)區(qū)融合肽段研究對 P-選凝素調(diào)控整合素的抑制效果；在 P-選凝素引起的整合素介導 的細胞黏附實驗中，以及 P-選凝素和整合素發(fā)揮關鍵作用的急性腹膜炎等動物模型中，確認此整合素活性調(diào)節(jié)機制的生理作用。同時我們還將研究在 P-選凝素引起白細胞整合素活化過程中，c-Cbl 被酪氨酸磷酸化的情況，及其隨 時間進程的 變化，探討 c-Cbl 活性如何受 Src 的調(diào)節(jié)，包括白 細胞中哪個 Src 激酶分子主導這一過程，c-Cbl 哪個關鍵酪氨酸殘基在這一過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用；研究在 P-選凝素信號刺激下 c-Cbl對 Src 的詳細調(diào)控機制， c-Cbl 對 Src 激酶泛素化過程以及蛋白降解過程的調(diào)節(jié)；利用 siRNA 或 c-Cbl 無活性突變體抑制 c-Cbl 的活性，研究 Src 和 c-Cbl 的相互調(diào)節(jié)對此信號通路所起到的負反饋調(diào)節(jié)作用；在 P-選凝素引起的整合素介導的細胞黏附實驗中，以及 P-選凝素和整合素發(fā)揮關鍵作用的急性腹膜炎等動物模型中，確認此負反饋調(diào)節(jié)機制的生理作用。我們還將研究選凝素與急性期蛋白 SAP 和 CRP 的相互作用特異性，利用缺失突變和位點特異性突變等試驗來尋找 SAP 和 CRP 結合 P-選凝素的關鍵氨基酸，用表面等離子共振技術檢測 SAP 和 CRP 與 P-選凝素結合的親合力和動力學，利用晶體結構分析研究 SAP 與 P-選凝素的關鍵結 合位點；用 SAP 轉(zhuǎn)基因小鼠和SAP 基因敲除小鼠研究 SAP 對炎癥反應的調(diào)控作用，并利用 SAP 純蛋白在選凝素介導的炎癥細胞黏附實驗中以及選凝素發(fā)揮關鍵作用的炎癥等動物模型中，確認急性期蛋白通過調(diào)節(jié)選凝素活性影響炎癥細胞黏附活性的生理作用。承擔單位：中國科學院上海生命科學研究院課題負責人： 耿建國，研究員，中國科學院上海生命科學研究院主要學術骨干：楊雪松，教授，暨南大學陳銘，副研究員，中國科學院上海生命科學研究院經(jīng)費比例：25％課題三 炎癥過程中細胞極性形成的信號轉(zhuǎn)導機制：研究目標：揭示炎癥相關整合素及其配體在細胞極性形成中的作用及其對白細胞的黏附和遷移的影響；闡明整合素功能調(diào)控及其相關信號轉(zhuǎn)導的機制；揭示細胞極性蛋白復合物 Par 復合物（Par3/Par6/aPKC）及其結合蛋白Lgl、Cdc42 在淋巴細胞激活、遷移和炎癥 發(fā)生、發(fā)展中的功能及其信號調(diào)控機制。研究內(nèi)容：本課題將研究細胞極性在淋巴細胞激活、遷移和炎癥發(fā)生發(fā)展中的功能及其信號調(diào)控機制，闡明黏附分子及其配體、重要 細胞極性蛋白復合物及其結合蛋白的生物學功能和分子機理。白細胞的滾動和穩(wěn)定黏附與其在內(nèi)皮細胞小靜脈的定位、捕獲和遷移有關。?4 整合素既可以介導白細 胞在其配體表面滾動，也可以介導白細胞的穩(wěn)定黏附，這一特性是通過對其親和性的動態(tài)調(diào)節(jié)實現(xiàn)的。而且，整合素對配體的親和性與細胞的極性，遷移和信號轉(zhuǎn)導相關。因此，研究? 4 整合素親和性動態(tài)調(diào)節(jié)機制和相關信號轉(zhuǎn)導機制對于我們了解細胞極性與白細胞運動的關系是非常重要的。我們將研究：整合素親和性動態(tài)調(diào)節(jié)的機制和結構基礎；整合素親和性動態(tài)調(diào)節(jié)對細胞極性與細胞遷移的影響；整合素介導的信號轉(zhuǎn)導。通過研究細胞極性蛋白復合物 PAR 復合物及其相關功能蛋白，探討細胞極性建立和維持與 T/B 淋巴細胞激活、遷移和炎癥發(fā)生之間的相互關系，希望闡明 PAR 復合物及其相關蛋白在這些生命活動中的作用機理，推動對復雜系統(tǒng)中不同的細胞活動間相互關系的認識，了解細胞極性如何影響淋巴細胞功能及其在炎癥中變化規(guī)律。具體內(nèi)容包括：細胞極性蛋白 Par 復合物及其結合蛋白在淋巴細胞極性形成機理研究； Par 復合物及其結合蛋白 對淋巴細胞功能的影響和信號調(diào)控機制；Par 復合物及其結合蛋白對淋巴細胞遷移的影響和信號調(diào)控機制；Par 復合物及其結合蛋白在炎癥中的作用和機制研究。我們將利用單分子力譜法，在納米級空間尺度上標定黏附分子在白細胞表面的分布以及活性。采用目前國際上常用的 K562 白細胞株作為樣品，K562 細胞將被轉(zhuǎn)入? 4 整合素，以及不同的趨化因子受體。利用原子力顯微鏡配合熒光顯微鏡成像的方法，我們將研究： K562 胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導引 發(fā)的胞外整合素介導的黏附力變化并測量變化的動力學過程；K562 細胞與人血管內(nèi)皮 細胞的黏附力以及在模擬炎癥條件下的相互作用變化過程；K562 細胞在受 趨化信號吸引下做定向遷移時，其 細胞前端和后緣的 納米級分辨率的形貌，黏附蛋白的分布以及活性。承擔單位：中國科學院上海生命科學研究院課題負責人： 陳劍峰，研究員，中國科學院上海生命科學研究院主要學術骨干：陳正軍，研究員，中國科學院上海生命科學研究院張曉暉，研究員，中國科學院上海生命科學研究院經(jīng)費比例： 16％課題四 炎癥過程中細胞遷移的信號調(diào)控及其分子基礎：研究目標：建立和完善研究細胞定向遷移的技術平臺，發(fā)現(xiàn)一系列調(diào)控細胞遷移的新的信號分子，并系統(tǒng)地研究 這些分子對細胞遷移的調(diào)控機制；結合原有研究基礎，建立從胞外、胞膜到胞內(nèi)調(diào)控細胞遷移的關鍵信號網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)調(diào) 控炎癥細胞定向遷移的新的信號途徑，并鑒定若干新的抗炎藥物作用靶位。研究內(nèi)容：本課題將系統(tǒng)地研究炎癥發(fā)生過程中調(diào)控細胞遷移的信號網(wǎng)絡及其調(diào)控機制。擬以參與炎癥發(fā)生過程中的各種白細胞和內(nèi)皮細胞為靶細胞，結合已有研究基礎，發(fā) 展研究細胞遷移的新技術，建立高效、系統(tǒng) 的細胞遷移研究技術平臺；系統(tǒng)地研究細胞外信號分子、 細胞膜表面受體群及細胞內(nèi)信號分子網(wǎng)絡對細胞遷移方向的決擇及遷移速度的調(diào)控；基于多種篩選技術，尋找并鑒定正向或負向調(diào)控細胞遷移的細胞因子及化合物；以蛋白質(zhì)組學為手段，鑒定白細胞遷移過程中的蛋白質(zhì)修飾的調(diào)控機制，并 鑒定調(diào)控細胞定向遷移關鍵信號蛋白復合體，研究調(diào)控白細胞遷移的各種信號通路間的新的對話機制；并結合功能基因組學，運用大規(guī)模 siRNA 篩選，尋找并 鑒定調(diào)控白細胞定向遷移的新的 調(diào)控分子及調(diào)控機制；結合細胞及模式動物技術，進一步研究這些新的調(diào)控分子對于炎癥及相關疾病的影響。探索從胞外信號與膜蛋白 GPCR 結合啟 動的信號傳遞過程，通 過研究磷脂代謝家族、小 G 蛋白家族到核 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng) 絡，系統(tǒng)深入的探索其與細胞遷移及炎癥的關系。選擇 關鍵的分子靶位， 篩選正向或負向調(diào)控細胞遷移的蛋白、短肽 、寡糖或化合物， 為控制炎癥細胞遷移提供新的技 術途徑。承擔單位：南方醫(yī)科大學課題負責人： 姜勇，教授，南方醫(yī)科大學主要學術骨干：王平，教授，華東師范大學經(jīng)費比例： 16％課題五 炎癥過程中細胞效應的信號轉(zhuǎn)導機制：研究目標：系統(tǒng)研究在炎癥過程中產(chǎn)生炎癥放大和組織損傷效應的炎癥細胞及其作用的靶細胞的信號轉(zhuǎn)導規(guī)律，闡明這些細胞合成和釋放炎癥因子等效應分子的調(diào)控方式，認識細 胞在炎癥環(huán)境下參與控制表達效應分子的新的信號分子及作用機制，從炎癥復合體、轉(zhuǎn)錄復合物等角度建立炎癥狀態(tài)下生物大分子相互作用的網(wǎng)絡的理論模型，力爭發(fā)現(xiàn)新的控制炎癥的藥物靶位。研究內(nèi)容：本課題擬研究的主要炎癥細胞為巨噬細胞，炎癥效應的靶組織則主要利用關節(jié)炎中的滑膜成纖維細胞為研究對象。在這些細胞探討在基因轉(zhuǎn)錄水平控制巨噬細胞 IL-1?、TNF-?等促炎細胞因子基因表達和表達產(chǎn)物成熟及釋放的信號分子及其轉(zhuǎn)導機制；在成纖維細胞則重點觀察 MMPs 等細胞外基質(zhì)降解酶的基因表達控制信號通路以及影響這些分子翻譯后加工及釋放的信號機制。在基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的研究中，將特別關注調(diào)控這些效應因子釋放的組蛋白修飾編碼、擴展對 NF-?B 等關鍵轉(zhuǎn)錄因子作用的 認識、系 統(tǒng)認識調(diào)節(jié)炎癥因子釋放的 miRNA 表達譜及其作用。具體內(nèi)容包括：（1）發(fā)現(xiàn)和鑒定炎癥效應相關的組蛋白去甲基化酶（如 H3K9me2 組蛋白去甲基化酶），闡明它們在調(diào)控炎癥效應因子（IL-1?、TNF-? 、MMPs）表達中的作用，利用 組蛋白去甲基化酶基因剔除小鼠研究組蛋白修飾與炎癥效應的關系；（2）觀察炎癥細胞及其他效應細胞在炎癥應激信號作用下的轉(zhuǎn)錄因子含量及活性變化、miRNA 種類和含量變化，分析這些變化對于炎癥效應信號（IL-1?、TNF-?、MMPs）的影響；（3）研究炎癥細胞及相關細胞在炎癥環(huán)境下細胞內(nèi)信號與細胞外基質(zhì)的相互作用，闡明細胞外基質(zhì)成分（膠原、纖連蛋白、整合素等）在炎癥環(huán)境下的變化及其對細胞炎癥效應的影響。在炎癥效應因子的翻譯后調(diào)控信號方面則重點研究在促炎細胞因子或MMPs 等的分泌調(diào)控中的重要蛋白 質(zhì)復合體，如炎癥復合體的形成及作用。系統(tǒng)而深入地研究炎癥復合體在病原侵入和應激刺激中形成的信號轉(zhuǎn)導機制，及信號網(wǎng)絡異常引起各種疾病的分子機理。擬通過規(guī)模性地蛋白質(zhì)相互作用篩選手段，尋找各種炎癥復合體介 導信號通路中新的蛋白分子，并研究其在信號網(wǎng)絡中的功能和分子作用機制；同時研究信號轉(zhuǎn)導關鍵分子 ASC 的復合體的形成，動態(tài)變化規(guī)律，并闡明蛋白翻 譯后修飾在此過程中的作用及對 NLRs 發(fā)揮功能的影響，為重大疾病的診治提供新策略和新靶點。承擔單位：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學課題負責人： 藥立波，教授，中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學主要學術骨干：陳德桂，研究員，中國科學院上海生命科學研究院錢友存，研究員，中國科學院上海生命科學研究院經(jīng)費比例： 16％課題六 抗炎活性化合物篩選及優(yōu)化：研究目標：針對本項目發(fā)現(xiàn)的與炎癥相關的新通路或靶標，建立快速可靠的活性化合物篩選模型，通 過通量 篩選、合理 藥物設計和結構優(yōu)化相結合的方法獲得高活性的化合物，并完成較全面的構效關系研究，獲得具有顯著抗炎效果的候選藥物化合物。并為進一步研究相關靶標在炎癥過程中的作用提供小分子化合物研究工具和探針。研究內(nèi)容：本課題將開展大量抗炎活性化合物的篩選及優(yōu)化研究工作。針對本項目發(fā)現(xiàn)的有效的抗炎新通路或靶標，利用分子和細胞生物學等方法建立快速可靠的篩選模型，并進行通量篩選 ，尋找相應靶標的小分子抑制劑。 對所獲得的活性化合物進行結構優(yōu)化，提高化合物對靶標的活性和選擇性，同時改善化合物的理化性質(zhì)等其它性質(zhì)。我們還將利用 Western Blot、RT-PCR、Co-IP、EMSA 等生化技術，以及免疫熒光分析、流式細胞儀分析等手段進一步 驗證化合物對靶標的生物學作用和選擇性等。此外，在了解藥物靶標的三維結 構的基礎上，我 們還將利用計算機輔助藥物設計等技術合理設計和合成對應相關生物靶標的小分子調(diào)節(jié)劑。在獲得針對生物靶標具有較好活性和選擇性的化合物后，我們一方面將利用動物模型研究這些化合物對炎癥反應的抑制作用，評價并改善其藥代動力學特性并提高化合物的安全性，以期以此為基礎開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權的新型抗炎藥物。另一方面，我們也將根據(jù)科學研究的需要， 對化合物進行生物素或熒光標記，為進 一步研究相關靶 標及其信號通路提供有力的小分子研究工具和探針。承擔單位：中國科學院上海有機化學研究所課題負責人： 俞飚，研究員，中國科學院上海有機化學研究所主要學術骨干：丁克，研究員，中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院經(jīng)費比例：11％（六）課題設置思路：本項目擬從炎癥細胞及其所處環(huán)境間相互作用的信號網(wǎng)絡和時空動態(tài)調(diào)控規(guī)律這一關鍵科學問題出發(fā)，主要以炎癥中細胞間相互作用為主線，以炎癥細胞間發(fā)生相互作用基本過程中的信號轉(zhuǎn)導機制為對象，并在前述基礎研究的引導下進行抗炎藥物的研發(fā)，彼此 間相互補充、有機 結合， 對炎癥的發(fā)生發(fā)展展開集中深入的研究。基于大量的文獻回顧、 長期的工作基 礎和儲備的人才隊伍，本 項目擬設立六個課題：課題一，炎癥過程中細胞識別的信號轉(zhuǎn)導機制；課題二，炎癥過程中細胞黏附的信號轉(zhuǎn)導機制；課題三，炎癥過程中細胞極性形成的信號轉(zhuǎn)導機制；課題四，炎癥過程中 細胞遷移的信號轉(zhuǎn)導機制；課題五，炎癥過程中細胞效應的信號轉(zhuǎn)導機制；課題六，抗炎活性化合物篩選及優(yōu)化。各課題間的有機聯(lián)系以及與項目預期目標的關系：炎癥反應的發(fā)生從本質(zhì)上講就是各種炎癥細胞在致炎/抗炎因子等作用下，通過不同的信號轉(zhuǎn)導機制發(fā)生相互作用的過程，包括了從炎癥細胞識別（課題一）炎癥信號與其它細胞或胞外基質(zhì)發(fā)生黏附（課題二），到炎癥細胞形成極性（課題三）并響應炎癥信號發(fā)生遷移（課題四），以及最終炎癥細胞發(fā)揮生物學效應（課題五）的整個過程，既有明確的階段和步驟，又是相互間密切聯(lián)系和時空有序的完整事件。治療炎癥性疾病是炎癥領域基礎研究的目的，通過對炎癥的發(fā)生發(fā)展進行細致的分子調(diào)控機制研究，發(fā)現(xiàn)新的抗炎藥物作用靶點，無疑將有力促進抗炎藥物研發(fā)（課題六）。本項 目包含的六個課題的設置相互間緊密相關，圍繞著揭示炎癥及其相關重大疾病中細胞間相互作用的信號轉(zhuǎn)導機制、促進抗炎藥物研發(fā)等應用研究的項目預期目標，展開系統(tǒng)深入的研究，課題間相互關聯(lián)、逐 漸延續(xù)、密切合作、互為指導， 組成一個完整的研究體系。課題間有機聯(lián)系示意圖四、年度計劃年度 研究內(nèi)容 預期目標第一年1. 研究包括DUSP1、Ets1、Ets2、Fli1、DPK 在內(nèi)的靶分子基因轉(zhuǎn)染對原代培養(yǎng)的單核巨噬細胞/樹突狀細胞 TLR 反應的影響。2. 在 mRNA、蛋白質(zhì)及功能水平探討FPR2 在 A?激活腦小膠質(zhì)細胞中的作用。3. 利用分子和細胞水平的炎癥細胞黏附實驗系統(tǒng)，研究選凝素與急性期蛋白 SAP之間的相互作用機理；研究 P-選凝素與PSGL-1 的結合如何引起 Src 激酶和 c-Cbl 之間 的相互 調(diào)節(jié)；研究不同白 細胞間對同一活化信號的不同響應機制。4. 研究炎癥相關黏附分子在雞胚早期發(fā)育中的時空表達模式，以此建立利用胚胎作為模式動物研究黏附分子的實驗模型。5. 研究整合素? 4?7 的親和性動態(tài)調(diào)控的機制。6. 完善和系統(tǒng)化原子力顯微和單細胞力譜技術，使之適用于探測遷移中的活體炎癥細胞。7. 建立血液 細胞（T/B 細胞）蛋白質(zhì)組學定量技術方法：SILAC, iTRAQ；對Par3、Par6、aPKC 和 Lgl 等極性蛋白質(zhì)復合物進行研究分析。8. 以參與炎癥發(fā)生過程中的各種白細胞和內(nèi)皮細胞為靶細胞，結合已有研究基 礎，發(fā)展研究細胞遷移的新技術，建立高效、系統(tǒng)的細胞遷移研究技術平臺。并建立相應的篩選技術包括功能基因組、shRNA篩選、蛋白質(zhì)組篩選。同時在此基礎之上，建立小分子化合物的篩選平臺。9. 用 TNF-?和 IL-8 等刺激和活化中性粒細胞，建立體外中性粒細胞黏附和遷移模型，結合抑制劑、基因共轉(zhuǎn)染技術，分析c-Abl 激 酶、? 2 整合素等蛋白的細胞分布、動態(tài)變化及對中性粒細胞黏附和遷移的影響。10. 探討 MAPK 通路信號分子，尤其是PRAK 在 細胞骨架調(diào)整中的作用及其機制。1. 發(fā)現(xiàn)新的對 TLR 反應具有調(diào)節(jié)作用的DUSP 及 Ets 家族蛋白分子。2. 明確 DUSP1、Ets1、Ets2、Fli1、DPK 等基因表達在體外對 TLR 介導的炎癥及固有免疫反應中的調(diào)節(jié)作用。3. 獲得足夠量的高純度目標蛋白質(zhì)以用于體外生化實驗以及結構分析。4. 獲得有效表達 FPR2 shRNA 的慢病毒載體；在細胞水平明確 FPR2 是介導 A? 所致腦部炎癥反應的關鍵分子。5. 揭示選凝素通過與 SAP 的相互作用調(diào)控炎癥細胞的黏附行為的分子機制，揭示Src 激酶與 c-Cbl 相互調(diào)控在炎癥細胞黏附活性調(diào)節(jié)中的作用，揭示不同白 細胞間對同一活化信號的不同響應機制。6. 采用原位雜交和免疫組化技術進一步完善黏附分子 E-Cadherin 和 N-Cadherin等在胚胎早期的表達，而后探討其它黏附分子。7. 揭示整合素親和性動態(tài)調(diào)控對白細胞在炎癥過程中的極性形成和運動的影響。8. 開發(fā)出測量單個活體細胞表面分子分布和活性的納米生物學方法。9. 從分子水平上，確定極性蛋白 Par 復合物在血液細胞的結合蛋白及其相互作用網(wǎng)絡圖；鑒定重要的功能性結合蛋白、確定其細胞定位和與 T/B 細胞功能的相關性。10. 建立多 樣化的、系統(tǒng)研究白 細胞、內(nèi)皮細胞等定向遷移技術平臺。11. 建立并完善相應的篩選技術平臺：包括相關功能基因家族的克隆、相關 shRNA收集及構建、鑒定及相關表達系 統(tǒng)的建立如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒等系統(tǒng) 、以及相關的蛋白質(zhì)組學技術的建立。12. 建立中性粒細胞鋪片培養(yǎng)，實時觀測并記錄細胞的黏附和延展實驗模型， 單層細胞劃痕實驗模型，體外 Transwell 中性粒細胞遷移及侵襲模型。明確 c-Abl 激酶等與細胞骨架相關動態(tài)變化等相關蛋白在中性粒細胞黏附和遷移中的作用。年度 研究內(nèi)容 預期目標11. 觀察炎癥細胞及其他效應細胞在炎癥應激信號作用下的轉(zhuǎn)錄因子含量及活性變化、miRNA 種類和含量變 化，分析 這些變化對于炎癥效應信號的影響。12. 構建核蛋白質(zhì)基因克隆庫, 用免疫組化方法高通量篩選新的組蛋白去甲基化酶, 并用高表達 Knockdown 目標基因在細胞內(nèi)鑒定組蛋白去甲基化酶的活性。13. 研究 TLR4 和 RIG-I 激活前體白介素－1 加工成熟通路的信號轉(zhuǎn)導機制；14. 通過 酵母雙 雜交系統(tǒng)、免疫共沉淀和GST－Pulldown 等手段篩選炎癥復合體中新的信號分子；15. 針對目前已被驗證過的抗炎藥物新靶標（主要針對尚無藥物上市的靶標）開發(fā)原創(chuàng)性的小分子調(diào)節(jié)劑作為新藥候選物。如針對與機體免疫反應密切相關的 JAK-STAT 信號轉(zhuǎn)導通路、與關節(jié) 炎（OA）密切相關的 ADAMTs 開發(fā)選擇性小分子調(diào)節(jié)劑劑等。建設小分子化合物 庫。13. 獲得研究需要的部分小鼠品系。14. 發(fā)現(xiàn)一些新的 MAPK 通路信號分子與細胞骨架的功能聯(lián)系。15. 發(fā)現(xiàn)炎癥信號作用下某些特定轉(zhuǎn)錄因子、miRNA 的變化；發(fā)現(xiàn)新的組蛋白去甲基化酶候選基因；在闡明 TLR 激活白介素－1 成熟加工的分子機制方面篩選出炎癥復合體中新的信號分子。16. 完成 STAT3，ADAMTs 的篩選模型建立，并進行活性評價和篩選。初步獲得針對 STAT3，ADAMTs 的先導化合物。17. 定向合成 200 個左右小分子化合物，充實小分子化合物庫。18. 在國際高水平學術雜志（IF>5）上發(fā)表10 篇以上論文，申請 2 項以上相關 專利，培養(yǎng)博士研究生 10 人以上。第二年1. 合成并篩選DUSP1、Ets1、Ets2、Fli1、DPK 等分子特異性干擾 RNA，研究內(nèi)源性 DPK 分子基因敲減對原代培養(yǎng)的單核巨噬細胞、 樹突狀細胞中 TLR 介導的炎癥細胞因子及 I型干擾素反應的影響。2. 鑒定目標蛋白質(zhì)及其復合物關鍵組分的生化特征。對目標蛋白質(zhì)及體外重構的復合物并進行單晶培養(yǎng)。3. 通過 RNA 干涉技術， 在急性 AD 小鼠模型探討 FPR2 在 A?42 所誘導腦部膠質(zhì)細胞侵潤和炎性細胞因子生成中的作用。4. 利用生化實驗和動物模型系 統(tǒng)，研究機體調(diào)控選凝素與 SAP 相互結合的分子機理；研究 P-選凝素與 PSGL-1 的結合如何引起 Jak2 激酶活化并進而活化 Src 激酶。5. 利用哮喘等模型，研究不同白 細胞對同一活化信號有不同響應的生理意義。6. 開發(fā)已知的常見黏附分子的基因干擾（over-expression and siRNA）的同 時，探 討1. 明確內(nèi)源性DUSP1、Ets1、Ets2、Fli1、DPK 等分子在體外對 TLR 介導的炎癥及固有免疫反應中的作用。2. 獲得目標蛋白質(zhì)及其復合物的翻譯后修飾特征。通過體外分析，建立目標蛋白質(zhì)復合物的動力學和熱力學參數(shù)。 獲得初步晶體生長條件。3. 在急性 AD 動物模型明確 FPR2 在 A?所致腦部炎癥反應中的作用。4. 揭示機體通過調(diào)控選凝素與 SAP 相互作用，影響炎癥細胞的黏附行 為的分子機制；揭示 Jak2 激酶在選凝素活化整合素信號通路中的重要作用；揭示噬酸性粒細胞在哮喘中的行為調(diào)控機制。5. 在明確目標 黏附分子基因的基 礎上，建立穩(wěn)定的基因干擾的條件，為 后續(xù)工作打下堅實的基礎。6. 闡明整合素相關的信號轉(zhuǎn)導與白細胞極性形成以及運動的關系。7. 揭示整合素的在白細胞遷移過程中的納米級空間分布、極性化過程及活性的 調(diào)年度 研究內(nèi)容 預期目標其它黏附分子干涉的相應條件， 設計構建 dominant negative 表達質(zhì)粒等。7. 研究整合素介導細胞雙向跨膜信號的機制及其生物學功能。8. 利用整合素配體修飾的探 針，用于探測上整合素的在白細胞遷移時的分布與活性。9. 從 細胞水平，建立單分子和高分辨率的免疫熒光技術，以及原子力 顯微鏡等先進的成像技術。利用上述技術 研究Par3/Par6 復合物及其結合蛋白在細胞水平的定位與細胞功能的變化相關性。10. 利用 RNAi 技術研究 Par 蛋白復合物的缺失對 T/B 細胞的功能以及細胞結構和功能不對稱性分布的影響。11. 從動物水平，開始著手制備 Par3 和/或 Par6 的組織特異性條件性基因敲除小鼠模型各種質(zhì)粒，或引進相應 的小鼠模型。12. 以蛋白 質(zhì)組 學為手段，鑒定白細胞遷移過程中的關鍵蛋白家族如 GPCR、小 G蛋白、磷脂代謝相關蛋白修飾 的調(diào)控機制。13. 結合功能基因組學，siRNA 等篩選技術，尋找并鑒定調(diào)控白細胞定向遷移的新的調(diào)控分子。14. 結 合酵母雙 雜交、蛋白質(zhì)免疫共沉淀和質(zhì)普分析技術，分析和鑒定在中性粒 細胞黏附和遷移過程中與 c-Abl 激酶和? 2 整合素相互作用的蛋白質(zhì)，及相互作用的 時空動態(tài)變化。15. 構建 CD18 的 CD4+T 細胞條件性基因剔除自身免疫性疾病的小鼠模型。16. 以 細胞骨架相關蛋白 為靶 標，使用蛋白質(zhì)免疫共沉淀、非變性凝膠 電泳、 GST-pulldown、DIGE 和質(zhì)普分析等多種技術鑒定相關信號蛋白復合體。17. 繼續(xù)觀察炎癥細胞及其他效應細胞在炎癥應激信號作用下的轉(zhuǎn)錄因子含量及活性變化、miRNA 種類和含量 變化， 進一步分析這些變化對于炎癥效應信號的影響?？貦C制。8. 在分子水平，進一步確定重要的功能性結合蛋白，及其細胞定位和與 T/B 細胞功能的相關性。9. 在細胞水平，確定極性蛋白 Par 復合物及結合蛋白細胞定位變化與細胞功能相關性。10. 預期將鑒定并發(fā)現(xiàn) 2-3 種調(diào)控在細胞定向遷移過程中起關鍵作用的信號分子的新機制包括新的修飾機制磷酸化、泛素化等、新的調(diào)控蛋白。11. 通過 siRNA 篩選，得到 2-3 種直接參與細胞定向遷移的蛋白。12. 在明確 c-Abl 激酶和 β2整合素在中性粒細胞黏附和遷移中作用的基礎上，通 過對相關復合物組分的動態(tài)分析， 鑒定出與上述兩種蛋白相互作用的蛋白及可能相互作用的環(huán)節(jié)，預期發(fā)現(xiàn) 1-2 種新的相互作用蛋白。13. 獲得 CD18 條件性基因剔除自發(fā)性自身免疫性疾病的小鼠模型。14. 鑒定出一些新的細胞骨架相關蛋白復合體，發(fā)現(xiàn)一些新的蛋白質(zhì)作用關系。15. 初步證實所發(fā)現(xiàn)的某些特定轉(zhuǎn)錄因子、miRNA 在炎癥相關細胞效應 中的作用；證實所發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶候選基因的活性；發(fā)現(xiàn)篩到新分子的部分功能；進一步闡明 NLR 激活白介素－1 成熟加工的分子機制。16. 利用不同模型完成對初篩到的STAT3，ADAMTs 的小分子先導化合物的驗證；針對先導化合物進行結構優(yōu)化；定向合成 200 個左右小分子化合物，充 實小分子化合物庫。17. 在國際高水平學術雜志（IF>5）上發(fā)表10 篇以上論文，申請 2 項以上相關 專利，培養(yǎng)博士研究生 10 人以上。年度 研究內(nèi)容 預期目標18. 表達和純化組蛋白去甲基化酶候選基因, 用質(zhì)譜和 Western blot 的方法在體外鑒定組蛋白去甲基化酶的活性, 并鑒定組蛋白去甲基化酶的催化機理。19. 研究 NLR 激活前體白介素－1 加工成熟通路的信號轉(zhuǎn)導機制，并與 TLR 介導白介素－1 加工機制比較。20. 通過 siRNA 等手段研究篩到的炎癥復合體中新分子的功能。21. 獲得 應激反應基因 NDRG2 的基因剔除小鼠，鑒定其一般表型變化。22. 對與機體免疫反 應密切相關的 JAK-STAT 信號轉(zhuǎn)導通路、與關節(jié) 炎（OA）密切相關的 ADAMTs 開發(fā)選擇性小分子調(diào)節(jié)劑劑等。建設小分子化合物 庫。第三年1. 觀察 DUSP、Ets1、Ets2、Fli1、DPK 等分子表達對 TLR 反應中 MAPK、NF-?B、IRF3、STAT1 等信號分子活化的影響，研究 DUSP、Ets、DPK 等分子與已知TLR 信號傳導分子間的相互作用。2. 通 過高通量 優(yōu)化篩選，結合蛋白質(zhì)工程的方法，對目標蛋白質(zhì)及其復合物的 單晶進行優(yōu)化，并進行衍射測試 。3. 將 FPR2 基因敲除小鼠與 APP 轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，觀察子代小鼠腦部病理 變化和學習記憶能力的改變。4. 利用 X-射線晶體衍射等技 術，研究 P-選凝素與 SAP 相互結合的精細位點；研究選凝素活化整合素信號通路中其它關鍵蛋白間的相互結合位點。5. 利用生化 實驗 和動物模型系 統(tǒng)，研究P-選凝素與 PSGL-1 的結合如何通過 Rho A 等小 GTP 酶引起整合素活化。6. 在黏附分子基因干擾的前提下，實時在體觀察細胞的生物學改變，如 細胞分裂、遷移和分化，以及所導致的形 態(tài)發(fā)生的變異，同時以基因表達的實驗作 為基因功能1. 明確 DUSP、Ets1、Ets2、Fli1、DPK 等分子對 TLR 信號傳導的調(diào)節(jié)作用， 闡明DUSP、Ets、DPK 等分子參與 TLR 信號傳導的分子機制。2. 采集用于結構解析的 X 射 線衍射數(shù)據(jù)。獲得初步晶體學分析結果以用于制定相應的結構解析方案。3. 闡明 FPR2 在 AD 發(fā)生發(fā)展中的作用。4. 揭示 P-選凝素與 SAP 相互結合的精細位點，揭示選凝素活化整合素信號通路中其它關鍵蛋白間的相互結合位點， 為尋找其結合特異抑制劑奠定基礎。揭示 Rho A等小 GTP 酶在炎癥細胞黏附活性調(diào)控中的重要作用。5. 明確相關黏附分子基因在胚胎發(fā)育中的功能，可能的情況下在小鼠胚胎加以驗證。6. 揭示整合素在炎癥細胞極性化和遷移過程中的構象變化機制。7. 在細胞水平，進一步確定極性蛋白 Par復合物及結合蛋白細胞定位變化與細胞功能相關性。年度 研究內(nèi)容 預期目標學研究的支撐。7. 研究整合素親和性調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導的結構基礎。8. 整合素抗體修飾的探針，通過不同表位的表達情況來分析整合素在膜上的構象。9. 利用 RNAi 和 Rescue 等技術確定 Par蛋白復合物對 T/B 細胞的功能以及細胞結構和功能不對稱性分布的影響的專一性。10. 在動物水平，完成 Par3 和/或 Par6 的組織特異性條件性基因敲除小鼠模型，或引進相應的小鼠模型并建立小鼠品系。初步分析小鼠的特定基因缺失的表形變化。11. 進一步研究新的調(diào)控分子及調(diào)控機制對于炎癥及相關疾病的影響。探索這些新靶點對在細胞過程中對胞外信號與膜蛋白 GPCR 結合啟動的信號傳遞、磷脂代 謝家族、小 G 蛋白家族到核轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡的影響，系統(tǒng)深入的探索 這些新分子及調(diào)控機制對細胞遷移的影響。12. 通過 GST-pulldown、far-western 等實驗，具體分析 c-Abl 激酶和? 2 整合素與復合體中相互作用蛋白的作用機制。包括是組成性結合，還是活化依賴的；是直接 結合和間接結合，以及對直接結 合的結構域進行分析。 13. 評估 CD18 條件性基因剔除小鼠模型自身免疫性疾病的表型、白細 胞的活化和多種炎癥因子的表達。14. 使用蛋白質(zhì)組學、CHIP 和 DNA-pulldown 技術，研究 IP-10 等 趨化因子的基因表達調(diào)控機制。15. 在應 激反應基因 NDRG2 的基因剔除小鼠觀察其炎癥環(huán)境下的細胞效應改變。16. 用 RT-PCR, Western blot analysis 鑒定組蛋白去甲基化酶、上述發(fā)現(xiàn) 的重要轉(zhuǎn)錄因子、miRNA 在炎癥效應產(chǎn)生中的表達變化, 并用 Knockdown 和過表達鑒定它們調(diào)控炎癥效應因子的作用。啟 動相應的基因剔除小鼠模型建立工作。17. 繼續(xù)研究 TLR 和 NLR 激活白介素8. 在動物水平，初步確定 Par 復合物及結合蛋白對炎癥細胞功能的影響。9. 預期明確所鑒定的新分子及調(diào)控方式對細胞遷移的影響，并在此基 礎之上，確定這些信號分子對細胞遷移信號網(wǎng)絡的影響，明確他們調(diào)控細胞信號遷移的具體機制。10. 闡明在中性粒細胞黏附和遷移過程中c-Abl 激 酶和 β2 整合素與相關蛋白作用的機制及其對功能發(fā)揮的調(diào)節(jié)作用。11. 獲得 CD18 條件性基因剔除自身免疫性疾病小鼠模型的表型、白細 胞的活化和多種炎癥因子的表達詳細數(shù)據(jù)。12. 發(fā)現(xiàn)一些新的 IP-10 等趨化因子基因表達的調(diào)節(jié)機制。13. 確 認 NDRG2 的基因剔除小鼠的炎癥調(diào)節(jié)變化及其意義。14. 建立 組蛋白去甲基化 酶 、上述 發(fā)現(xiàn)的重要轉(zhuǎn)錄因子、miRNA 與炎癥的相關性, 證明其 causal effect, 構建基因打靶質(zhì)粒和 ES 細胞。15. 比較說明 TLR 和 NLR 信號轉(zhuǎn)導在白介素－1 成熟加工中的分子機制的異同；建立所發(fā)現(xiàn)的新分子的基因剔除小鼠模型。16. 對已發(fā)現(xiàn)的先導化合物進行進一步結構優(yōu)化并確認其體內(nèi)、外藥效。定向合成200 個左右小分子化合物，充 實小分子化合物庫。完成新靶標篩選模型的建立并 進行篩選。17. 在國際高水平學術雜志（IF>5）上發(fā)表10 篇以上論文，申請 2 項以上相關 專利，培養(yǎng)博士研究生 10 人以上。年度 研究內(nèi)容 預期目標－1 成熟加工的分子機制。根據(jù) 細胞水平的功能研究結果，篩選重要新分子 進行基因剔除小鼠模型的構建。18. 與機體免疫反 應密切相關的 JAK-STAT 信號轉(zhuǎn)導通路、與關節(jié) 炎（OA）密切相關的 ADAMTs 開發(fā)選擇性小分子調(diào)節(jié)劑等。建設小分子化合物庫 。19. 在本項目發(fā)現(xiàn)的有效新靶標及建立有效篩選模型的基礎上進行活性篩選。第四年1. 建立 DUSP、Ets、DPK 等分子基因缺陷小鼠模型，觀察 DUSP、Ets、DPK 等基因缺陷對小鼠模型中 TLR 反應的影響，其對內(nèi)毒素休克、EAE 、CIA 等炎癥或炎癥性自身免疫病的影響。2. 對目標蛋白質(zhì)單體以及復合物進行結構解析，結合其他生物物理手段研究目 標復合物的構象與裝配特征，初步建立分子機制模型并設計突變研究。3. 探討去甲腎上腺素對腦小膠質(zhì)細胞攝取和降解 A?42 的影響。4. 利用 ELISA 等實驗系統(tǒng)，篩選能特異阻斷選凝素/SAP 蛋白復合物形成的小分子；篩選可特異阻斷選凝素活化整合素細胞通路的小分子；篩選可特異阻斷噬酸性粒細胞黏附遷移調(diào)控信號的小分子。5. 研究相關黏附分子的細胞內(nèi)傳導通路，如鈣離子信號是否參與調(diào)控、 Slug 等轉(zhuǎn)錄因子的作用等。6. 構建低活性整合素? 4?7 knock-in 小鼠模型。7. 利用活細胞修飾的探針測量附著在探針上的白細胞與內(nèi)皮細胞的相互作用。8. 結 合分子水平和 細胞水平研究 結果，進一步深入探討 Par 蛋白復合物參與炎癥細胞生物學功能的分子機理。9. 以細胞遷移過程中已有的及新鑒定的關鍵分子為靶位，篩選正向或 負向調(diào)控細1. 明確 DUSP、Ets、DPK 等分子在體內(nèi)對 TLR 反應的調(diào)節(jié)作用；明確DUSP、E