DBS61 0007-2015 食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 飲料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法.docx

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DBS61 陜 西 省 食 品 安 全 地方標(biāo)準(zhǔn) DB S61/0007—2015 飲料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 Determination of 4-(5-)-methylimidazole and 2-methylimidazole in beverage by Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometric method 2015 - 02-28發(fā)布 2015 -03 -28實(shí)施 陜西省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布 DBS61/0007—2015 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1-2009給出的規(guī)則起草。 請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。 本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B均為資料性附錄。 本標(biāo)準(zhǔn)由陜西省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布并歸口。 本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)陜西出入境檢驗(yàn)檢驗(yàn)局提出并起草。 本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張璐、何強(qiáng)、鄒陽(yáng)、李瑩、付騁宇、孔祥虹、李建華、吳雙民。 本標(biāo)準(zhǔn)屬首次發(fā)布。 飲料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飲料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）的檢測(cè)方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于碳酸飲料、特殊用途飲料、茶飲料、咖啡飲料等中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的測(cè)定。 2 規(guī)范性引用文件 下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法 3 原理 試樣中的4-甲基咪唑和2-甲基咪唑經(jīng)水溶解或稀釋，振蕩后，陽(yáng)離子固相萃取柱（MCX）凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。 4 試劑與材料 除非另有說(shuō)明，在分析中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和GB/T6682中規(guī)定的一級(jí)水。 4.1 標(biāo)準(zhǔn)品：4-甲基咪唑（CAS：822-36-6， C4H6N2）和2-甲基咪唑（CAS：693-98-1， C4H6N2）含量均≥ 98.0 %。 4.2 內(nèi)標(biāo)物：氘代4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)品：含量≥ 99.0 %。 4.3 甲醇：色譜純。 4.4 乙腈：色譜純。 4.5 甲酸：色譜純。 4.6 甲酸銨。 4.7 氨水。 4.8 MCX固相萃取柱：60 mg/3mL，或相當(dāng)者。 4.9 甲酸水溶液（2 %）：準(zhǔn)確量取2 mL甲酸和98 mL水，混合后備用。 4.10 氨水甲醇溶液（5 %）：準(zhǔn)確量取5 mL氨水和95 mL甲醇，混合后備用。 4.11 甲酸銨溶液（5 mmol/L）：準(zhǔn)確稱取0.0945 g甲酸銨溶解于300 mL水中，混合后備用。 4.12 乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液（9:1, V/V）：準(zhǔn)確量取90 mL乙腈和10 mL 5 mmol/L甲酸銨（4.11）,混合備用。 4.13 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 mg/mL）：分別準(zhǔn)確稱取4-甲基咪唑和2-甲基咪唑各10 mg，用甲醇溶解定容至10 mL，搖勻，0 ℃～4 ℃避光保存，有效期1年。 4.14 內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（1 mg/mL）：準(zhǔn)確稱取氘代4-甲基咪唑10 mg，用甲醇溶解定容至10 mL，搖勻，0 ℃～4 ℃避光保存，有效期1年。 4.14 混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（1 mg/mL）： 分別準(zhǔn)確量取1 mg/mL 4-甲基咪唑和2-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0.025 mL，于25 mL容量瓶中，用乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液（4.12）溶解，定容于25 mL，0 ℃～4 ℃避光保存，有效期6個(gè)月。 4.15 氘代4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(1 mg/mL) ：準(zhǔn)確量取1 mg/mL氘代4-甲基咪唑內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液0.025 mL，于25 mL容量瓶中，用甲醇溶液，定容于25 mL，0 ℃～4 ℃避光保存，有效期6個(gè)月。 4.16 混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：根據(jù)需要，臨時(shí)吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（4.14）和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（4.15），用乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液（4.12）稀釋配制適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，每毫升混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中含有氘代4-甲基咪唑?yàn)?.01 mg。 5 儀器與設(shè)備 5.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源。 5.2 分析天平：感量0.01 mg。 5.3 天平：感量0.01 g。 5.4 振蕩器 5.5 渦旋混勻器 5.6 離心機(jī) 5.7 固相萃取裝置 5.8 氮吹儀 5.9 聚四氟乙烯離心管：15 mL。 5.10 濾膜：0.22 mm。 6 試樣制備與保存 取有代表性試樣500 g，混合均勻，裝入潔凈容器中，密閉并標(biāo)明標(biāo)記，冷藏保存。 7 測(cè)定步驟 7.1 提取 準(zhǔn)確稱取試樣3 g（精確至0.01 g），于15 mL離心管中，加入氘代4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（4.15）100 mL，用水溶解或稀釋，定容至10 mL，振蕩10 min。4500 r/min下離心5 min，待凈化。 7.2 凈化 MCX固相萃取柱依次用甲醇3 mL和水5 mL活化，取待凈化液過(guò)柱，控制流速1滴/3～4 s，依次用2 %甲酸水溶液（4.9）5 mL和甲醇5 mL淋洗，再用5 %氨水甲醇溶液（4.10）9 mL洗脫，收集洗脫液，于40 ℃氮?dú)獯蹈?。用乙?5 mmol/L甲酸銨溶液（4.12）1 mL溶解殘?jiān)?，渦旋混勻，濾膜（5.10）過(guò)濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。 7.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 準(zhǔn)確量取1 mg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液和1 mg/mL氘代4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)中間溶液適量，用乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液（4.12）稀釋，配制成9.0，15.0，50.0，100.0，500 .0 mg/L系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，其中氘代4-甲基咪唑濃度為10 mg/L，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。以目標(biāo)化合物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。 7.4 測(cè)定 7.4.1 液相色譜條件 色譜柱：HILIC （2.1×100 mm，1.7 mm）, 或相當(dāng)者； 柱溫：40 ℃； 流速：0.3 mL/min； 進(jìn)樣量：2.0 mL; 流動(dòng)相：乙腈+5 mmol/L甲酸銨溶液（9+1，V/V），等度洗脫； 7.4.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源; 掃描方式：正離子掃描； 檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)； 電離電壓：2.9 kV； 離子源溫度： 115 ℃； 脫溶劑氣溫度：350 ℃； 脫溶劑氣：600 L/h； 錐孔氣：50 L/h； 定性、定量離子對(duì)及對(duì)應(yīng)的錐孔電壓和碰撞電壓見(jiàn)表1 表1a 4-甲基咪唑和2-甲基咪唑定性、定量離子對(duì)和錐孔電壓及碰撞電壓 化合物 定性離子對(duì) 定量離子 錐孔電壓 碰撞電壓 4-甲基咪唑（4-Mel） 82.9/42.1 82.9/55.9 30 15 82.9/55.9 14 2-甲基咪唑（2-Mel） 82.9/42.1 82.9/42.1 37 14 82.9/55.9 14 氘代4-甲基咪唑（4-Mel-d6） 88.0/60.1 88.0/60.1 30 15 a對(duì)于不同質(zhì)譜儀器，儀器參數(shù)可能存在差異，測(cè)定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。 非商業(yè)性聲明：表1所列參數(shù)是在Waters ACQUITY UPLC-Quattro Premier質(zhì)譜儀完成的，此處列出的實(shí)驗(yàn)用儀器僅是為了提供參考，并不涉及商業(yè)目的，鼓勵(lì)標(biāo)準(zhǔn)使用者嘗試不同型號(hào)的儀器。 7.4.3 測(cè)定法 按照7.4.1和7.4.2液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件測(cè)定試樣和混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（4.16），按內(nèi)標(biāo)法以峰面積比計(jì)算?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)使用溶液及試樣溶液中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑和氘代4-甲基咪唑的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍之內(nèi)。試樣溶液中的離子對(duì)相對(duì)豐度與混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液的離子相對(duì)豐度比符合表2的要求。在上述色譜條件下4-甲基咪唑和2-甲基咪唑參考保留時(shí)間分別為1.96 min和2.63 min。標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子流圖參見(jiàn)附錄A中圖A.1。 表2 試樣溶液中離子相對(duì)豐度的允許偏差范圍 相對(duì)豐度（%） ＞50 ＞ 20～50 ＞10～20 ≤10 允許偏差（%） ±20 ±25 ±30 ±50 7.5 空白試驗(yàn) 除不加試樣外，均按上述測(cè)定條件和步驟進(jìn)行。 8 結(jié)果計(jì)算和表達(dá) 計(jì)算或峰面積比值，標(biāo)準(zhǔn)曲線校正。 其中：—4-甲基咪唑定量離子對(duì)峰面積； —2-甲基咪唑定量離子對(duì)峰面積； —氘代4-甲基咪唑峰離子對(duì)面積； 由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程： 求得和，則 試樣中4-甲基咪唑或2-甲基咪唑殘留量（mg/kg）：按下式計(jì)算： 式中： —混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液中4-甲基咪唑或2-甲基咪唑的峰面積； —混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液中內(nèi)標(biāo)氘代4-甲基咪唑的峰面積； —混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液中內(nèi)標(biāo)氘代4-甲基咪唑的濃度，單位為微克每升，mg/L； —混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液中4-甲基咪唑或2-甲基咪唑，單位為微克每升，mg/L； —試樣中4-甲基咪唑或2-甲基咪唑的濃度，單位為微克每升，mg/L； —試樣中4-甲基咪唑或2-甲基咪唑的峰面積； —試樣中內(nèi)標(biāo)氘代4-甲基咪唑的峰面積； —試樣中待分析物的殘留量，單位為微克每千克（mg/kg）； —溶解殘余物的體積，單位為毫升，mL； —試樣質(zhì)量，單位為克，g。 注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值，測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。 9 定量限、回收率和精密度 9.1 定量限 本方法對(duì)4-甲基咪唑、2-甲基咪唑的定量限均為10.0 mg /kg。 9.2 回收率 碳酸飲料、特殊用途飲料、茶飲料、咖啡飲料中4-甲基咪唑、2-甲基咪唑的回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)附錄B.1，在10.0~75.0 mg/kg添加濃度水平上的回收率范圍為88.8 %~119.9 %。 9.3 精密度 本方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤10 %。 附 錄 A （資料性附錄） 圖A.1 4-甲基咪唑（4-Mel）、2-甲基咪唑（2-Mel）和氘代4-甲基咪唑（4-Mel-d6）的選擇離子色譜圖（10 mg/kg） 附 錄 B （資料性附錄） 4-甲基咪唑和2-甲基咪唑殘留檢測(cè)的添加回收率數(shù)據(jù) 表B.1 碳酸飲料、特殊用途飲料、茶飲料、咖啡飲料中4-甲基咪唑和2-甲基咪唑添加濃度及回收率（n=5） 樣品 化合物 添加水平 （mg/kg） 回收率 （%） 碳酸飲料 4-甲基咪唑 10 89.0~95.0 25 98.4~119.9 50 105.2~111.7 75 95.0~112.4 2-甲基咪唑 10 92.5~96.1 25 88.4~104.4 50 99.4~104.4 75 109.7~118.7 特殊用途飲料 4-甲基咪唑 10 96.6~100.1 25 97.6~103.6 50 98.1~102.5 2-甲基咪唑 10 96.7~98.7 25 99.3~100.9 50 98.1~102.5 茶飲料 4-甲基咪唑 10 88.9~92.3 25 99.2~104.4 50 97.8~102.8 2-甲基咪唑 10 98.8~100.4 25 96.9~98.8 50 97.8~102.2 咖啡飲料 4-甲基咪唑 10 94.0~99.0 25 98.5~110.4 50 91.9~98.8 2-甲基咪唑 10