【基金標(biāo)書】2010CB912800-惡性腫瘤非編碼RNA相關(guān)蛋白的功能網(wǎng)絡(luò)與調(diào)控機制的研究

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項目名稱： 惡性腫瘤非編碼 RNA 相關(guān)蛋白的功能網(wǎng)絡(luò)與調(diào)控機制的研究首席科學(xué)家： 宋爾衛(wèi) 中山大學(xué)起止年限： 2010 年 1 月-2014 年 8 月依托部門： 教育部一、研究內(nèi)容本項目擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題是“惡性腫瘤非編碼 RNA 相關(guān)蛋白的功能網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機制及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展和治療抗性的關(guān)系”，包括以下四個方面： 1）新的腫瘤 ncRNA 及相關(guān)蛋白的發(fā)現(xiàn)和作用機制；2）腫 瘤 ncRNA 轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)運、加工及修飾過程中相關(guān)蛋白的功能；3）ncRNA 相關(guān)蛋白在 腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用；4）ncRNA 相關(guān)蛋白與腫瘤治療抗性的關(guān)系。圍繞上述科學(xué)問題，本項目擬以我國常見的惡性腫瘤為疾病模型，研究腫瘤細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)如何參與 ncRNA 的生物合成與基因調(diào)控功能，并探索它 們之間的相互作用對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，以及與腫瘤發(fā)生發(fā)展和治療抗性的關(guān)系。主要研究內(nèi)容包括：1）建立和優(yōu)化適合于腫瘤研究的 ncRNA 組學(xué)方法和 ncRNA 相關(guān)蛋白研究體系， 篩選和鑒定一批新的 腫瘤相關(guān) ncRNA 及其相互作用蛋白；2）探索 DNA 甲基化和組蛋白修飾及轉(zhuǎn)錄 因子對腫瘤 ncRNA 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，以及相關(guān)蛋白在 ncRNA 轉(zhuǎn)運、加工及修飾過程中的作用；3）探討ncRNA 及其相關(guān)蛋白對腫瘤啟動細(xì)胞自我增殖、分化方向和成瘤特性的 調(diào)控機制，闡明其與腫瘤發(fā)生的關(guān)系。研究 ncRNA 及其相關(guān)蛋白在腫瘤發(fā)展過程中對腫瘤細(xì)胞 EMT，腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成的作用； 4）研究 ncRNA 及其相關(guān)蛋白調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡、自噬的機制，解析常見惡性腫瘤中 ncRNA 及其相關(guān)蛋白對治療抗性的影響。二、預(yù)期目標(biāo)本項目的總體目標(biāo)以常見的惡性腫瘤為模型，通過研究非編碼 RNA（ncRNA）相關(guān)蛋白的功能網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機制，發(fā)現(xiàn)一批新的腫瘤 ncRNA 及相關(guān)蛋白并揭示其作用機制； 闡明腫瘤 ncRNA 轉(zhuǎn)錄、 轉(zhuǎn)運、加工及修飾過程中相關(guān)蛋白的功能；解析 ncRNA 相關(guān)蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用以及 ncRNA 相關(guān)蛋白與腫瘤治療抗性的關(guān)系，使我國在惡性腫瘤 ncRNA 相關(guān)蛋白研究領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展， 為我國在該領(lǐng)域培養(yǎng)一批優(yōu)秀人才。 本項目的五年預(yù)期目標(biāo)1．建立適合于腫瘤研究的 ncRNA 相關(guān)蛋白的各種平臺，包括適合于 腫瘤研究的 ncRNA 組學(xué)技術(shù)平臺， 腫瘤特異 ncRNA 相互作用蛋白質(zhì)高通量篩選和分析技術(shù)平臺；建立計算生物學(xué)和實驗生物學(xué)有機結(jié)合的研究方法，系統(tǒng)分析和鑒定一批新的不同長度和不同類型腫瘤特異性 ncRNA 及相關(guān)蛋白，揭示 ncRNA及相關(guān)蛋白的相互作用機制。2．發(fā)現(xiàn) 30-40 個新的參與惡性腫瘤功能網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的 ncRNA 相關(guān)蛋白，包括參與腫瘤 ncRNA 基因的 DNA 甲基化、組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄，以及腫瘤 ncRNA 轉(zhuǎn)運、加工及成熟修飾的相關(guān)蛋白；調(diào)節(jié)腫瘤啟動細(xì)胞自我增殖、多向分化，成瘤能力等生物學(xué)特性的 ncRNA 相關(guān)蛋白；調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞 EMT 和抗凋亡特性，以及腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成和治療抗性的 ncRNA 相關(guān)蛋白，為闡明惡性腫瘤 ncRNA 相關(guān)蛋白功能網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機制提供新線索。3. 闡明 ncRNA 相關(guān)蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展和治療抗性中的新的調(diào)控機制，包括腫瘤特異 ncRNA 相關(guān)蛋白的表觀遺傳調(diào)控機制，ncRNA 相關(guān)蛋白對腫瘤啟動細(xì)胞的調(diào)控機制，ncRNA 相關(guān)蛋白對對腫瘤血管生成、以及腫瘤細(xì)胞遷移和 EMT 的調(diào)控機制，ncRNA 相關(guān)蛋白對腫瘤細(xì)胞凋亡、自噬和治療抗性的調(diào)控機制，深入研究 10-20 種左右具有臨床意義的非編碼 RNA 及相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)至少 2－3 條新的 ncRNA 相關(guān)蛋白參與的調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展和治療抗性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為人類認(rèn)識腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制和治療癌癥提供理論依據(jù)。4．預(yù)計在 SCI 收錄雜志發(fā)表論文 80 篇以上，其中 IF>5 分以上論文超過 40篇，爭取在 Cell、Nature、Science等頂尖雜志上發(fā)表高水平論文，申請專利 10-15個。5．為我國在惡性腫瘤 ncRNA 相關(guān)蛋白研究領(lǐng)域培養(yǎng)一批高水平 創(chuàng)新性人才，包括培養(yǎng) 15-20 名博士后等青年骨干人才， 70－ 80 名博士生， 100 名碩士生，產(chǎn)生百篇優(yōu)秀博士論文 1-2 篇。三、研究方案1.總體學(xué)術(shù)思路：以非編碼 RNA（ncRNA）相關(guān)蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在腫瘤發(fā)生發(fā)展與治療抗性中的作用研究作為總體目標(biāo)，本 項目擬識別和鑒定一批腫瘤特異的 ncRNA，篩選并確定參與它們在腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)及行使生物學(xué)功能的相關(guān)蛋白質(zhì)。此外，探索ncRNA 與相關(guān)蛋白之間的相互作用機制，及其 對腫 瘤細(xì)胞增殖、分化、 轉(zhuǎn)移、凋亡和治療抗性等的作用，最終闡 明腫瘤非編碼 RNA 相關(guān)蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)及功能，為人類認(rèn)識腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制和治療癌癥提供理論依據(jù)?？傮w研究方案圖示如下：ncRNA 與調(diào)控其表達(dá)的蛋白相互作用識別和鑒定腫瘤ncRNA 與相關(guān)蛋白ncRNA 與行使其生物功能的蛋白相互作用ncRNA 對靶蛋白的作用與腫瘤發(fā)生發(fā)展 與腫瘤治療抗性解析腫瘤 ncRNA表達(dá)的調(diào)控機制? 表觀遺傳機制對 ncRNA 表達(dá)的調(diào)控? 轉(zhuǎn)錄因子對ncRNA 的調(diào)控? ncRNA 合成、加工成熟與修飾過程及其與蛋白質(zhì)相互作用的機理? 腫瘤啟動細(xì)胞及其在各向分化過程中的ncRNA 及相關(guān)蛋白的時空表達(dá)譜? ncRNA 相關(guān)蛋白對腫瘤啟動細(xì)胞的調(diào)控與腫瘤發(fā)生? ncRNA 相關(guān)蛋白對腫瘤血管生成的調(diào)控作用? ncRNA 相關(guān)蛋白參與腫瘤細(xì)胞遷移、EMT和腫瘤轉(zhuǎn)移的機制研究? 腫瘤細(xì)胞凋亡與自噬過程相關(guān)的 ncRNA及相關(guān)蛋白的篩選與鑒定? ncRNA 相關(guān)蛋白對腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬過程的調(diào)控作用研究? ncRNA 相關(guān)蛋白在納米顆粒引發(fā)的癌細(xì)胞自噬中的功能? ncRNA 相關(guān)蛋白對惡性腫瘤治療抵抗作用的研究惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中的 ncRNA 及其相關(guān)蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)? 識別和鑒定新的腫瘤特異 ncRNA 及與其靶蛋白的作用機制? 解析調(diào)控腫瘤 ncRNA 轉(zhuǎn)錄和加工修飾的蛋白質(zhì)功能? 闡明 ncRNA 相關(guān)蛋白對腫瘤啟動細(xì)胞的調(diào)控作用與腫瘤發(fā)生的關(guān)系? 揭示 ncRNA 相關(guān)蛋白對腫瘤血管生成與轉(zhuǎn)移的作用與腫瘤發(fā)展的關(guān)系? 探索 ncRNA 相關(guān)蛋白對腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬的作用與腫瘤治療抗性的關(guān)系技術(shù)途徑及可行性：本項目在總體目標(biāo)的架構(gòu)下分為 4 個主要的課題方向（見課題設(shè)置），各課題方向的主要技術(shù)途徑總結(jié)如下：課題 1：利用 RNA 組學(xué)研究方法，采用深度測序技術(shù)、DNA 文庫、基因芯片技術(shù)，高通量篩選和鑒定新的 腫瘤相關(guān) ncRNA；采用基于生物 質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)、酵母三雜交技術(shù) 、SELEX 技術(shù)、免疫沉淀-RNA:隨機聚合酶鏈反應(yīng)方法，以及 CLIP(crosslinking and immunoprecipitation)方法、蛋白復(fù)合體分離 檢測技術(shù)，結(jié) 合生物信息學(xué)技術(shù) ，規(guī)?；叵到y(tǒng)性篩選、 鑒定腫瘤特異性 ncRNA 相互作用蛋白，發(fā)現(xiàn) ncRNA 與蛋白質(zhì)相互作用規(guī)律。 課題 2：通過 DAC/TSA 處理法結(jié)合 MSP 和 ChIP 法，篩選、鑒定受表觀遺傳調(diào)控的 ncRNA；通過 DNA 親和層析、ChIP-Seq、 熒光素酶報告系統(tǒng)等方法在腫瘤細(xì)胞中檢測轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的結(jié)合活性；通過免疫共沉淀、酵母三雜交、SELEX、CLIP 等技術(shù)分離和 鑒定與 ncRNA 結(jié)合蛋白；用篩選調(diào)控轉(zhuǎn)錄后加工關(guān)鍵蛋白的 miRNA；應(yīng)用用免疫共沉淀方法鑒定 ncRNA 修飾蛋白，如 lin-28 等和候選 miRNA 前體的結(jié)合及體外催化實驗鑒定惡性腫瘤細(xì)胞系中 ncRNA 修飾蛋白介導(dǎo)的候選 miRNA 前體尿嘧啶化；應(yīng)用測序技術(shù)對 ncRNA 基因多態(tài)性進(jìn)行分析。課題 3：通過 ncRNA 芯片、ncRNA 克隆和深度測序鑒定腫瘤啟動細(xì)胞特異的 ncRNA 表達(dá) 譜；通過生物信息學(xué)預(yù)測、蛋白組學(xué)、蛋白差異表達(dá)分析以及RNA 干 擾實驗研究分離和鑒定 ncRNA 相關(guān)蛋白；通 過平皿培養(yǎng)、三 維 Matrigel培養(yǎng)、免疫缺陷鼠移植瘤系統(tǒng)、 ncRNA 表達(dá)/拮抗實驗 研究 ncRNA 在腫瘤啟動細(xì)胞中的生物學(xué)功能。采用劃痕修復(fù)試驗、 轉(zhuǎn)移小室（Transwell ）的細(xì)胞遷移和侵潤檢測系統(tǒng)和荷瘤鼠轉(zhuǎn)移模型等研究腫瘤轉(zhuǎn)移能力；采用倒相性、熒光和共聚焦顯微技術(shù)觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)；采用小動物成像系統(tǒng)技術(shù)，動物外周學(xué)循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測技術(shù)，組織學(xué)檢測技術(shù)以及熒光定量 PCR 技術(shù)等檢測 ncRNA 干預(yù)對惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的作用；通過免疫組化和免疫細(xì)胞化學(xué)等檢測轉(zhuǎn)移細(xì)胞 ncRNA 相關(guān)的蛋白通路激活狀態(tài)。課題 4：通過親和層析法、酵母三雜交系統(tǒng)、 ChIP-RT-PCR 等技術(shù)篩選和鑒定 ncRNA 相關(guān)的凋亡蛋白；應(yīng)用 THF 方法制備富勒烯納米顆粒；用動態(tài)光散射、透射電鏡、 HPLC 等技術(shù)測 定納米顆粒的粒徑、表面電勢、濃度及分散度等理化性質(zhì)；通過熒光觀察 GFP-LC3 聚集， western 檢測 LC3-I 向 LC3-II 的轉(zhuǎn)化，電子顯微鏡觀察自噬體及自噬溶酶體，western 檢測 p62 和 Free GFP 等進(jìn)行自噬檢測；通過檢測細(xì)胞自噬特征性的 GFP-LC3 點狀聚集， 篩選 自噬相關(guān) ncRNA；采用Western Blotting,免疫組化以及酶活性檢測等手段研究 ncRNA 生成過程中的重要蛋白質(zhì)如 Drosha、Dicer 以及 Argonaute 2 在細(xì)胞自噬過程中表達(dá)水平、分子形式以及細(xì)胞內(nèi)定位可能的變化。本研究團隊中有相當(dāng)部分的研究人員具有多年從事腫瘤學(xué)或腫瘤學(xué)相關(guān)基礎(chǔ)研究的科研經(jīng)驗，其中在 Cell、Nature、Science、N Engl of Med 系列雜志上發(fā)表的文章中與腫瘤相關(guān)的占 60％。各課題組建立了適合于腫瘤研究的 ncRNA 相關(guān)蛋白的實驗平臺和分析平臺，包括上述絕大部分技術(shù)途徑，建立了多種化學(xué)致癌物誘導(dǎo)人體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的模型，建立了腫瘤啟動細(xì)胞的研究平臺以及富集腫瘤啟動細(xì)胞的動物模型和細(xì)胞模型，建立了多種腫瘤細(xì)胞抗性模型，這些均為本研究奠定了堅實的基礎(chǔ)，保 證了該項目的順利進(jìn)行。2.創(chuàng)新點與特色理論方面創(chuàng)新：（1）首次研究以 ncRNA 為核心的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)：本研究從 ncRNA與蛋白質(zhì)的相互作用入手，全面系統(tǒng)地解析以 ncRNA 為紐帶的蛋白質(zhì)功能網(wǎng)絡(luò)對腫瘤的作用。一方面研究腫瘤細(xì)胞內(nèi)調(diào)控 ncRNA 轉(zhuǎn)錄和加工的蛋白質(zhì)功能，另一方面研究 ncRNA 與其相關(guān)蛋白組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)著腫瘤細(xì)胞編碼蛋白質(zhì)的癌基因和抑癌基因的表達(dá)，從而參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的多種生命現(xiàn)象。這一觀點的提出與論證將為完善一個多通路、多層次的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以解析惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展機制奠定基礎(chǔ)。（2）為惡性腫瘤的治療提供新靶點：腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及多個編碼基因的變異，而細(xì)胞內(nèi)源性的 ncRNA-蛋白 質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)，因此，改項目將為惡性腫瘤的治療提供更穩(wěn)定有效的抗癌靶點。此外，腫瘤啟動細(xì)胞是腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源，對化療和放療不敏感。本 項 目通過篩選決定腫瘤啟動細(xì)胞分化和生長命運的 ncRNA 及其相關(guān)蛋白，不 僅為 治療惡性腫瘤提供了新的靶點，還提供了合適的靶細(xì)胞群，這將成為新一代的腫瘤基因治療手段。（3）為研究 ncRNA 相關(guān)蛋白調(diào)控腫瘤提供新的模型：本項目將著眼于惡性腫瘤內(nèi)維持其生長的特殊細(xì)胞群——腫瘤啟動細(xì)胞，通過篩選、識別和鑒定參與調(diào)節(jié)惡性腫瘤啟動細(xì)胞基因表達(dá)的 ncRNA 及其相關(guān)蛋白質(zhì)，研究它 們對腫瘤啟動細(xì)胞分化命運的調(diào)控作用，從而為 ncRNA-蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究提供了一個動態(tài)的嶄新的生物學(xué)模型。此外，最新的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞自噬與治療抵抗有關(guān)，本研究通過分析自噬過程中 ncRNA 相關(guān)蛋白的功能，闡述其對腫瘤治療抵抗的作用，為研究腫瘤治療敏感性提供新模型。（4）在部分交叉研究領(lǐng)域進(jìn)行首次研究：有關(guān) ncRNA 及其相關(guān)蛋白調(diào)控腫瘤治療抗性的研究在國際上才剛剛展開，目前尚缺乏系統(tǒng)和深入的研究；此外，目前文獻(xiàn)中尚未有 ncRNA 相關(guān)蛋白調(diào)控細(xì)胞自噬的報道，結(jié)合課題組溫龍平教授團隊首次發(fā)現(xiàn)的納米顆?？梢酝ㄟ^ ncRNA 調(diào)控細(xì)胞自噬，為納米生物學(xué)及納米安全性研究提供新線索。技術(shù)方法創(chuàng)新：（1）RNA 組學(xué)平臺在腫瘤特異 ncRNA 篩選中應(yīng)用：本研究將采用 RNA 組學(xué)方法，并結(jié)合深度測序和計算生物學(xué)方法，建立高通量篩選和鑒定 ncRNA 技術(shù)平臺，將有效地發(fā)現(xiàn)不同長度和類型的新的腫瘤特異的 ncRNA。（2）腫瘤相關(guān) ncRNA 相互作用蛋白系統(tǒng)研究：本研究采用基于生物質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)、酵母三雜交技術(shù)、 SELEX 技術(shù)、CLIP(crosslinking and immunoprecipitation)方法以及蛋白復(fù)合體分離檢測技術(shù)等多種新技術(shù)新方法，并有機結(jié)合計算生物學(xué)方法，理論與實驗科學(xué)相結(jié)合，高通量和特異性相結(jié)合，是一種新的 ncRNA 相互作用蛋白研究策略。 這也是國內(nèi)首次開展大 規(guī)模的腫瘤特異的 ncRNA 及其相關(guān)蛋白的發(fā)現(xiàn)和作用機制研究。3.課題設(shè)置1）課題設(shè)置的思路本研究項目從發(fā)現(xiàn)和鑒定惡性腫瘤特異的非編碼 RNA(ncRNA)與其相關(guān)蛋白質(zhì)出發(fā)，分別從 ncRNA 調(diào)節(jié)軸心的上游和下游研究 ncRNA 和相關(guān)蛋白的相互作用及相互調(diào)控機制，并 闡述 ncRNA 及其相關(guān)蛋白在 腫瘤自然發(fā)生發(fā)展和治療抵抗等病理過程中的作用。課題的設(shè)置圍繞這一學(xué)術(shù)思路展開，分為 4 個分課題：（1）腫瘤 ncRNA 及其相互作用蛋白的系統(tǒng)識別 與機制研究；（2）腫瘤 ncRNA轉(zhuǎn)錄加工相關(guān)蛋白的功能研究；（3）ncRNA 相關(guān)蛋白 對腫瘤啟動細(xì)胞和腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用，及其與腫瘤發(fā) 生發(fā)展的關(guān)系；（4）ncRNA 相關(guān)蛋白質(zhì)調(diào)控腫瘤細(xì)胞程序性死亡以及治療抗性的功能研究。課題一：腫瘤非編碼 RNA 及其相互作用蛋白的系統(tǒng)識別與機制研究1.研究內(nèi)容：1）篩選和鑒定新的腫瘤相關(guān)非編碼 RNA以人常見腫瘤(肝癌、乳腺癌和食管癌等)細(xì)胞系和人癌組織及正常組織標(biāo)本為研究對象，建立和發(fā)展高通量 ncRNA 篩選和鑒定技 術(shù)平臺，針對不同的研究目的采用多種不同途徑獲得腫瘤特異的 ncRNA 分子。具體技術(shù)途徑可包括：(1)采用 RNA 組學(xué)研究方法，分離制備 RNA，采用羅氏 454 測序技術(shù)或 Illumina Solexa 測序技 術(shù)等方法， 進(jìn)行高通量測序分析和大規(guī)模篩選。 （2）分離制備 ncRNA分子，構(gòu)建不同大小的 ncRNA 的 cDNA 文庫(size-fractioned RNA library) （包括我們建立非編碼小分子 RNA 建庫技術(shù)，F(xiàn)EBS lett.2005,579: 3849-3854）和消減文庫，對文 庫進(jìn)行大規(guī)模篩選 和高通量測序分析。 (3)采用 Invitrogen 公司最新推出的為檢測長 ncRNA 設(shè)計的 NCode Noncoding RNA Array（包含 17112 個人ncRNA 分子）獲得腫瘤特異的長度大于 200bp 的候選 ncRNA 分子；采用 miRNA芯片分析，獲得腫瘤特異的候選 miRNA 分子。針對獲 得的新數(shù)據(jù)和已有數(shù)據(jù)，結(jié)合生物信息學(xué)方法高通量發(fā)現(xiàn)新的不同長度和類型的 ncRNA 分子， 獲得常見腫瘤 ncRNA 表達(dá)譜， 篩選差異表達(dá) ncRNA，獲得常見腫瘤特異表達(dá)的候選ncRNA 分子。針對獲得的腫瘤特異的候選 ncRNA 分子，采用 Northern blot、原位雜交 和/或?qū)崟r定量 PCR 等技術(shù)對 大樣本腫瘤和正常組織標(biāo)本及癌細(xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步鑒定分析，最終獲得腫瘤( 肝癌、乳腺癌和食管癌等 )ncRNA 表達(dá)譜和特異表達(dá)ncRNA。2）系統(tǒng)分析和鑒定腫瘤特異非編碼 RNA 的相互作用蛋白質(zhì)建立和完善規(guī)模化的腫瘤特異 ncRNA 相互作用蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)、 篩選和分析的規(guī)范化技術(shù)體系，獲得一批與 腫瘤特異 ncRNA 相互作用蛋白 質(zhì)分子。針對獲得的腫瘤特異 ncRNA 分子，采用基于生物 質(zhì)譜分析的蛋白 質(zhì)組學(xué)技術(shù)、篩選和鑒定 RNA 與蛋白質(zhì)相互作用的酵母三雜交技術(shù)、SELEX(systematic evolution of Ligands by exponential enrichment)技術(shù)、免疫沉淀 -RNA:隨機聚合酶鏈反應(yīng)方法，以及 CLIP(crosslinking and immunoprecipitation)方法、蛋白復(fù)合體分離檢測技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)，篩選 、鑒定腫瘤特異性 ncRNA 相互作用候選蛋白質(zhì)。經(jīng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)外驗證，獲得一批 腫瘤 ncRNA 相互作用蛋白 質(zhì)分子，為 ncRNA 相關(guān)蛋白的生物學(xué)功能研究提供保證。miRNA 是目前哺乳動物細(xì)胞研究最成熟的 ncRNA，在分析和 鑒定 miRNA靶基因蛋白方面，本項目研究人員中山大學(xué)生科院的蔣嵩山副教授前期的研究構(gòu)建了 600 多個人 miRNA 基因的慢病毒表達(dá)載體和質(zhì)粒表達(dá)載體，通過內(nèi)源性提高 miRNA 的表達(dá)，并進(jìn) 行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，系 統(tǒng) 地篩查腫瘤相關(guān) miRNA 的靶基因。結(jié)合通過同位素標(biāo)記氨基酸的 SILAC 方法，可獲得相關(guān)度非常高的miRNA-靶蛋白調(diào)節(jié)關(guān)系。在生物信息學(xué)軟件預(yù)測的參考下，通過熒光素酶報告系統(tǒng)對 miRNA-靶蛋白調(diào)節(jié)關(guān)系進(jìn)行鑒定，最終系統(tǒng)地獲得腫瘤相關(guān) miRNA 的調(diào)節(jié)譜，作為后續(xù)研究的基礎(chǔ)。3）腫瘤特異非編碼 RNA 與相互作用蛋白的作用機制闡明 ncRNA 與蛋白質(zhì)相互作用的序列和結(jié)構(gòu)規(guī)律對揭示 ncRNA 與相互作用蛋白質(zhì)分子的作用機制具有重要意義。首先針對獲得的 ncRNA 相互作用蛋白質(zhì)，采用 計算生物學(xué)方法，以實驗證實的 ncRNA 與蛋白相互作用為基礎(chǔ)，開展基于機器學(xué)習(xí)的 ncRNA 與蛋白相互作用研究。探 討三個 問題：①與某一特定蛋白結(jié)合的若干 RNA 的結(jié)合區(qū)特征識別；②與某一特定 類型 RNA 結(jié)合的若干蛋白的結(jié)合區(qū)特征識別；③開展基于機器學(xué) 習(xí)的 ncRNA 與蛋白相互作用的預(yù)測研究，構(gòu)建分類模型，預(yù)測與某一特定 ncRNA 結(jié)合的所有可能蛋白或與某一蛋白 結(jié)合的所有可能 ncRNA，最 終為實驗提供計算生物學(xué)支持。結(jié)合計算生物學(xué)的分析結(jié)果，對獲得的腫瘤特異的 ncRNA 分子進(jìn)行堿基或序列片段 進(jìn)行替換、缺失，采用規(guī)?；芯康鞍踪|(zhì)與 RNA 相互作用技術(shù)在細(xì)胞內(nèi)外探索 ncRNA 與蛋白質(zhì)相互作用，揭示蛋白質(zhì)-ncRNA 的相互作用方式， 進(jìn)而 發(fā)現(xiàn) ncRNA 與蛋白質(zhì)相互作用的序列和結(jié)構(gòu)規(guī)律，為基 礎(chǔ)和應(yīng)用研究提供條件。4）腫瘤特異非編碼 RNA 相互作用蛋白在腫瘤中的定性、定量和定位研究針對獲得的腫瘤特異 ncRNA 及其相互作用蛋白質(zhì)， 對各種常見腫瘤標(biāo)本進(jìn)行定性、定量和細(xì)胞定位分析，揭示其在腫瘤中表達(dá)的 動態(tài)時空關(guān)系。 應(yīng)用Northern Blot、實時定量 RT-PCR 技術(shù)和原位雜交等原位技術(shù)對腫瘤相關(guān) ncRNA的表達(dá)進(jìn)行定位和定性研究，以確認(rèn)腫瘤相關(guān) ncRNA 及其相關(guān)的靶基因蛋白在惡性腫瘤中的上調(diào)/下調(diào)關(guān)系。應(yīng)用 Western Blot 和免疫組織化學(xué)技術(shù)，對腫瘤相關(guān) ncRNA 相關(guān)蛋白在惡性腫瘤中的表達(dá)進(jìn)行定量或半定量檢測。 結(jié)合表達(dá)譜篩選數(shù)據(jù)，對腫瘤相關(guān) ncRNA 及相互作用蛋白的角色即癌基因 /抑癌基因進(jìn)行確認(rèn)，并與功能研究銜接。 2.研究目標(biāo)：1）建立腫瘤非編碼 RNA 相互作用蛋白質(zhì)高通量篩選和分析技術(shù)平臺。2）系統(tǒng)分析和鑒定一批新的不同長度和不同類型腫瘤特異性非編碼 RNA 及相關(guān)蛋白，揭示非編碼 RNA 及相關(guān)蛋白的相互作用機制。承擔(dān)單位： 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院課題負(fù)責(zé)人：鄭曉飛研究員經(jīng)費比例：23.71%課題二：腫瘤非編碼 RNA 轉(zhuǎn)錄加工相關(guān)蛋白的功能研究1.研究內(nèi)容：1）腫瘤 ncRNA 表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控DNA甲基化和組蛋白修飾是ncRNA表觀遺傳學(xué)調(diào)控的主要形式，ncRNA之間的表達(dá)調(diào)控也屬于表觀遺傳學(xué)調(diào)控的范疇。首先通過分析腫瘤表觀遺傳學(xué)改變與ncRNA表達(dá) 譜之間的關(guān)系獲得候選的表觀遺傳 學(xué)調(diào)控的ncRNA 。然后驗證ncRNA表達(dá)和啟 動子區(qū)域DNA甲基化的對應(yīng)關(guān)系，并比較DNA 甲基化酶抑制劑（DAC）處理前后相關(guān)ncRNA的表達(dá)情況，確 認(rèn)ncRNA表達(dá)受DNA 甲基化調(diào)控。應(yīng)用抗活性乙酰化(acetyl-H3K9) 和甲基化組蛋白抗體（ dimethyl-H3K4、H3K36）特異識別處于活化狀態(tài)的染色質(zhì)；同時應(yīng)用抗失活染色質(zhì)的甲基化組蛋白抗體(trimethyl-H3K9、H4K20和trimethyl-H3K27) 進(jìn)行染色 質(zhì)免疫沉淀分析；結(jié)合TSA處理前后ncRNA的表達(dá)與組蛋白修飾狀態(tài)以明確組蛋白修飾對ncRNA 的調(diào)控作用。ncRNA 本身也可通過與甲基化相關(guān)蛋白的相互作用 進(jìn)而調(diào)控其它基因和ncRNA的表達(dá)。本研究還將通過分析腫瘤相關(guān)ncRNA的表達(dá)與DNMTs 活性的關(guān)系篩選出調(diào)控DNMTs的候選ncRNA，并對其蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。2）腫瘤 ncRNA 轉(zhuǎn)錄因子的識別與功能鑒定為了識別和鑒定腫瘤 ncRNA 的轉(zhuǎn)錄因子，本 課題首先 應(yīng)用 ncRNA 啟動子區(qū)域作為誘餌從蛋白庫中篩選出與其特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，并通過功能實驗探討該蛋白對腫瘤 ncRNA 轉(zhuǎn)錄的影響，并 進(jìn)一步鑒定該轉(zhuǎn)錄 因子所調(diào)控的 ncRNA 轉(zhuǎn)錄譜。另一方面，應(yīng)用 ChIP-Seq 方法在腫瘤細(xì)胞中檢測并篩選與已知的腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，如 c-myc、p53 等相結(jié)合的 ncRNA 基因啟動子區(qū)域，以獲得腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的 ncRNA 基因啟動子結(jié)合譜。3）腫瘤 ncRNA 成熟加工的機制ncRNA 在轉(zhuǎn)錄后至成熟過程中，需 經(jīng)過多種蛋白和 酶類的調(diào)控，我們將在腫瘤模型中研究 ncRNA 轉(zhuǎn)錄后加工相關(guān)蛋白的表達(dá)情況、并分析 過度表達(dá)或敲低后對腫瘤相關(guān) ncRNA 表達(dá)譜的影響。通 過免疫共沉淀、酵母三雜交、SELEX、CLIP 等技術(shù)分離和 鑒定此過程中的調(diào)控蛋白并研究其功能。我們也將選擇與各類 ncRNA 成熟加工相關(guān)的蛋白分子（如與 miRNA 加工相關(guān)的 Drosha、Dicer 及 Argonaute 2 等），將其基因的 3’-UTR 克隆至雙熒光素酶報告系統(tǒng)，采用課題組 1 創(chuàng)建的 miRNA 表達(dá)庫在全基因 組范圍內(nèi)系統(tǒng)地篩選可能調(diào)控這些蛋白的 miRNA，并 結(jié)合課題 1 中所鑒定的常 見惡性腫瘤特異性 ncRNA表達(dá)譜，通過兩者交集探討惡性腫瘤特異性 miRNA 對 ncRNA 在轉(zhuǎn)錄后至成熟過程的負(fù)反饋調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。4）腫瘤成熟 ncRNA 異常修飾的機制近期研究發(fā)現(xiàn)，ncRNA在代謝過程中被異常修飾將會 導(dǎo)致其降解，從而影響細(xì)胞內(nèi)成熟ncRNA的水平。例如 lin28通過調(diào)節(jié)let-7前體尿嘧啶化介導(dǎo)的let-7前體降解。因此，本課題將識別和鑒定一批異常修飾腫瘤相關(guān)ncRNA 而導(dǎo)致其表達(dá)改變的蛋白質(zhì)，并探討其作用機制。在腫瘤標(biāo)本中分析從 課題1中篩選、 鑒定的ncRNA相關(guān)蛋白與ncRNA表達(dá)水平的相關(guān)性。通過在腫瘤細(xì)胞系中過度表達(dá)或用RNAi 方法沉默該候選蛋白的表達(dá)，觀察不同成熟階段的相關(guān)ncRNA的表達(dá)變化。進(jìn)一步通過CLIP(crosslinking and immunoprecipitation)方法和體外催化實驗鑒定相關(guān)蛋白與ncRNA的結(jié)合以及對其修飾的方式。此外，ncRNA 的序列多態(tài)性也是影響其成熟加工的重要因素。本 課題將應(yīng)用測序技術(shù)對 ncRNA 基因多態(tài)性進(jìn)行分析，明確 SNP 對腫瘤相關(guān) ncRNA 成熟加工的影響。2.研究目標(biāo)：1）明確腫瘤 ncRNA 表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控機制及相關(guān)蛋白（酶）在 ncRNA-蛋白調(diào)控網(wǎng)路中的作用。2）分離和鑒定一批新的調(diào)控腫瘤相關(guān) ncRNA 的轉(zhuǎn)錄因子，并揭示其在ncRNA-蛋白 調(diào)控網(wǎng)路中的作用。3）獲得一批腫瘤 ncRNA 加工成成熟過程及成熟后異常修飾相關(guān)的蛋白并闡明其功能。承擔(dān)單位： 中國人民解放軍總醫(yī)院課題負(fù)責(zé)人： 郭明洲研究員經(jīng)費比例：22.12%課題三、非編碼 RNA 相關(guān)蛋白 對腫瘤啟動細(xì)胞和腫 瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)控及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系1.研究內(nèi)容：1）完成腫瘤啟動細(xì)胞的 ncRNA 及相關(guān)蛋白表達(dá)譜腫瘤啟動細(xì)胞在腫瘤組織內(nèi)數(shù)量稀少，是制約其高通量分子表達(dá)譜研究的瓶頸，課題組前期研究建立了高效的腫瘤啟動細(xì)胞篩選富集體系，即通過低劑量化療選擇壓力，在荷瘤鼠中選擇出具有高比例腫瘤啟動細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞株。該研究體系可以推廣到其他惡性實體瘤，以獲得足夠數(shù)量的腫瘤啟動細(xì)胞供本研究所用。我們將（1）以各類常見惡性腫瘤的啟動細(xì)胞作為材料，采用不同大小的 ncRNA 的 cDNA 文庫（size-fractioned RNA library）和腫瘤啟動細(xì)胞體外球囊培養(yǎng)擴增等策略構(gòu)建各種腫瘤啟動細(xì)胞專一性的小分子 ncRNA 的 cDNA 文庫。對文庫進(jìn)行大規(guī)模篩選和序列測定分析，預(yù)期可發(fā)現(xiàn)一批腫瘤啟動細(xì)胞特異的ncRNA。（2）結(jié)合 ncRNA 芯片及克隆測序技術(shù)，分析比較腫瘤啟動細(xì)胞和相應(yīng)的非啟動癌細(xì)胞中 ncRNA 表達(dá)譜的差異，以及 腫瘤啟 動細(xì)胞在向上皮型和間質(zhì)型成熟癌細(xì)胞分化過程中 ncRNA 表達(dá)譜的變化，發(fā)現(xiàn) 和鑒定腫瘤啟動細(xì)胞特異表達(dá)的新 ncRNA。在此基 礎(chǔ)上，我 們將在原發(fā)惡性腫瘤組織中分離原代的腫瘤啟動細(xì)胞，通過 Northern 雜交法鑒定新發(fā)現(xiàn)的專一 ncRNA 表達(dá)，通過實時 PCR 對其定量，再通過原位雜交對其定位。 （3）通過計算機預(yù)測系統(tǒng)和蛋白組學(xué)技術(shù)分析和鑒定 ncRNA 相關(guān)的蛋白譜，并鑒定 ncRNA 相關(guān)蛋白質(zhì)在各類原代腫瘤啟動細(xì)胞的表達(dá)及其與 ncRNA 表達(dá)的相關(guān)性。2）ncRNA 相關(guān)蛋白對腫瘤啟動細(xì)胞的調(diào)控作用通過前期研究所建立的一系列腫瘤啟動細(xì)胞研究模型，分析 ncRNA-蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對腫瘤啟動細(xì)胞生物學(xué)特性，包括自我增殖能力、多向分化的潛能和體內(nèi)成瘤能力的調(diào)控作用。 （1）自我增殖是腫瘤啟動細(xì)胞賴以維持自我的主要特征，也是惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展的源泉。無血清培養(yǎng)條件下， 腫瘤啟動細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下形成細(xì)胞球囊（sphere），球囊形成率反映細(xì)胞自我增殖的能力。我們將進(jìn)行專一性的 ncRNA 干預(yù)，然后分析 腫瘤啟動細(xì)胞球囊形成率，并通過蛋白差異表達(dá)分析以及相關(guān) RNA 干擾實驗明確 ncRNA 相關(guān)蛋白與 腫瘤啟動細(xì)胞球囊形成和自我增殖能力的關(guān)系。 （2）采用二維平皿及三維 Matrigel 培養(yǎng)和免疫缺陷鼠體內(nèi)種植等研究體系，并利用上皮細(xì)胞和間葉細(xì)胞的表面標(biāo)記物，進(jìn)一步明確目標(biāo)ncRNA 對腫瘤啟 動細(xì)胞分化方向的影響。 （3）檢測過 表達(dá)或沉默 ncRNA 后腫瘤啟動細(xì)胞成瘤能力的變化，并分析 ncRNA 相關(guān)蛋白的 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以闡明 ncRNA-蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與腫瘤發(fā)生的關(guān)系。3）ncRNA 相關(guān)蛋白對腫瘤轉(zhuǎn)移的作用在課題 1 識別和鑒定腫瘤特異 ncRNA 和相關(guān)蛋白特異表達(dá)譜的基礎(chǔ)上，我們將進(jìn)一步篩選鑒定與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的 ncRNA 及其相關(guān)蛋白，在體外和體內(nèi)模型中研究這些 ncRNA 及其相關(guān)蛋白質(zhì)對腫 瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移特性的調(diào)節(jié)作用與機制。首先，我們在腫瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)目標(biāo) ncRNA 的表達(dá)序列或者其拮抗序列，然后：①采用劃痕修復(fù)和轉(zhuǎn)移小室（Transwell）技術(shù)檢測 ncRNA 干預(yù)對腫瘤細(xì)胞遷移（Migration ）和侵襲（Invasion）的作用，并分析相關(guān)蛋白通路的激活狀態(tài)；②采用倒相性、熒光和共聚焦顯微技術(shù)，以及 Matrigel 細(xì)胞三維培養(yǎng)系統(tǒng)觀察ncRNA 干預(yù)對腫瘤細(xì)胞 EMT 形狀的作用，并鑒定調(diào)節(jié) EMT 的蛋白信號分子的激活狀態(tài)；③在免疫缺陷鼠 腎包膜或皮下種植以及鼠尾靜脈注射 腫瘤細(xì)胞，采用活體成像技術(shù)，組織病理學(xué)檢測以及熒光定量 PCR 等技術(shù)檢測 ncRNA 對惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用，同時，通 過免疫組化和免疫熒光等檢測轉(zhuǎn)移細(xì)胞 ncRNA相關(guān)的蛋白通路激活狀態(tài)。4）ncRNA 相關(guān)蛋白對腫瘤血管生成的調(diào)控作用腫瘤血管生成是惡性腫瘤發(fā)展過程的重要事件，研究證實腫瘤細(xì)胞可以通過分泌促血管生成因子， 誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤組織遷移并增殖，也可以誘導(dǎo)組織內(nèi)多能干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，腫瘤啟動細(xì)胞也可向血管樣內(nèi)皮的方向分化，形成腫瘤的新生血管。因此，本 課題中我們將探索在惡性腫瘤的微環(huán)境中 ncRNA-相關(guān)蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng) 絡(luò)對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化與遷移的調(diào)控作用，及其與腫瘤血管生成的關(guān)系。具體研究內(nèi)容包括：① 基于課題 1 所建立的 ncRNA 及其相關(guān)蛋白的檢測平臺，在與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的模型里，分析正常組織干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化過程中，以及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖過程中 ncRNA 及其相關(guān)蛋白的時空變化規(guī)律，篩選 出與血管內(nèi)皮增殖和分化相關(guān)的 ncRNA 及其相關(guān)蛋白；②通過在血管內(nèi)皮細(xì)胞以及正常組織干細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)ncRNA 表達(dá)序列或其拮抗序列，分析上述篩選的 ncRNA 及其相關(guān)蛋白對腫瘤細(xì)胞所誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化和遷移的作用；③ 在腫瘤啟動細(xì)胞向血管樣內(nèi)皮細(xì)胞分化的模型中，通 過轉(zhuǎn)導(dǎo)上述篩選的 ncRNA 表達(dá)序列或拮抗序列，分析其調(diào)控作用。2.研究目標(biāo)：1）完成腫瘤啟動細(xì)胞的 ncRNA 及相關(guān)蛋白表達(dá)譜2）揭示 ncRNA 相關(guān)蛋白對腫瘤啟動細(xì)胞的調(diào)控機制及其與腫瘤發(fā)生的關(guān)系3）闡明 ncRNA 相關(guān)蛋白對腫瘤血管生成、侵 襲、 轉(zhuǎn)移和 EMT 轉(zhuǎn)化的調(diào)控機制承擔(dān)單位：中山大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：宋爾衛(wèi)教授經(jīng)費比例：30.46%課題四：非編碼 RNA 相關(guān)蛋白質(zhì)調(diào)控腫瘤細(xì)胞程序性死亡以及治療抗性的功能研究1. 研究內(nèi)容：1）ncRNA 相關(guān)蛋白在腫瘤細(xì)胞凋亡中的功能研究利用課題 1 中系統(tǒng)篩選和鑒定所得到的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的 ncRNA，在 細(xì)胞及動物整體水平上揭示這些 ncRNA 所調(diào)控的靶蛋白參與細(xì)胞凋亡的傳導(dǎo)通路，并闡明這些 ncRNA 相關(guān)蛋白影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機理。在此基礎(chǔ)上，我們將從調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白入手，針對性地選擇在凋亡過程中起關(guān)鍵作用的（master regulator）促凋亡或抗凋亡 調(diào)控蛋白（例如 p53、E2F1、Puma、Bax、Bcl-2、Bcl-xL 等），將這些基因的 3’-UTR 克隆表達(dá)，然后利用課題 1 創(chuàng)建的 miRNA表達(dá)庫來系統(tǒng)篩選影響凋亡/抗凋亡的新的 ncRNA；我們還將利用 IP-ChIP 和酵母三雜交系統(tǒng)尋找與這些 3’-UTR 相結(jié)合的蛋白，進(jìn)一步探索這些與 3’-UTR 相互作用的新的 ncRNA 和新的蛋白(novel proteins)是如何通過調(diào)控細(xì)胞凋亡或抗凋亡來影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。miR-17-92 cluster 是目前公認(rèn)的第一個非編碼癌基因（Noncoding oncogene，OncomiR-1）,它在許多腫瘤中都呈現(xiàn)高表達(dá)。Mir-17-92 本身是受 Myc正調(diào)控，但它又能正向調(diào)控 E2F1、PTEN 以及 Bim 等眾多由它們介導(dǎo)的腫瘤調(diào)控網(wǎng)絡(luò)通路；Mir-17-92 同 時還受到 hnRNPA1 的成熟加工的調(diào)控，因此，miR-17-92 是研究 ncRNA 凋亡網(wǎng)絡(luò)的典范。我 們初步的研究 證實：B23 通過與 hnRNPA1相互作用調(diào)控 mir-17-92 的在細(xì)胞內(nèi)的水平。因此，我們將以 mir-17-92 的研究為切入點，探索它參與細(xì)胞凋亡和腫瘤發(fā)生的復(fù)雜的分子調(diào)控機理。2）ncRNA 相關(guān)蛋白在腫瘤細(xì)胞自噬中的功能研究以我們已構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá) GFP-LC3 蛋白的乳腺癌和 HeLa 癌細(xì)胞系為實驗系統(tǒng)，利用 課題 1 創(chuàng)建的 ncRNA 表達(dá)庫， 篩選出能誘導(dǎo)或抑制癌細(xì)胞自噬的ncRNA，然后鑒定這些 ncRNA 的靶蛋白及其調(diào)控細(xì)胞自噬的分子機理；針對性地選擇一些已知在細(xì)胞自噬過程中起著關(guān)鍵調(diào)控作用的關(guān)鍵蛋白質(zhì)如 Beclin-1和 ATG5，篩選 能調(diào)控這些蛋白質(zhì)表達(dá)水平的 ncRNA，并驗證所得到的 ncRNA在細(xì)胞自噬過程中的功能；探討 ncRNA 生成過程中的重要蛋白質(zhì)如Drosha、Dicer 以及 Argonaute 2 在細(xì)胞自噬過程中表達(dá)水平、分子形式以及細(xì)胞內(nèi)定位可能的變化；在現(xiàn)有工作基礎(chǔ)上進(jìn)一步確認(rèn) ncRNA 及相關(guān)蛋白在納米顆粒引發(fā)的癌細(xì)胞自噬中的變化，并通過過表達(dá)和 Knock-down 等手段揭示這些ncRNA 及相關(guān)蛋白在細(xì)胞自噬中所起的作用。3）ncRNA 相關(guān)蛋白在腫瘤治療抗性中的功能研究（1）腫瘤治療抗性相關(guān)模型建立與組織樣本的收集：建立一系列針對各類腫瘤治療產(chǎn)生抵抗作用的腫瘤治療抗性模型，包括對化療、放療、內(nèi)分泌治 療和靶點藥物治療的抗性模型；收集在術(shù)后經(jīng)歷了不同種類的輔助治療的病人的樣本并制作組織芯片，同時收集病人的臨床治療和完成 5 年隨訪工作。（2）腫瘤治療抗性相關(guān) ncRNA 的篩選和鑒定：一方面運用腫瘤治療抗性相關(guān)模型和課題 1 建立的方案分離和構(gòu)建不同大小的 ncRNA 文庫(size-fractioned RNA library)和消減文 庫，運用 Illumina Solexa 測序技術(shù)等方法對文庫進(jìn)行大規(guī)模篩選和高通量測序分析，結(jié)合生物信息學(xué)方法高通量發(fā)現(xiàn)新的 ncRNA 分子以及篩選差異表達(dá) ncRNA，獲得腫瘤治療抗性特異表達(dá)的候 選 ncRNA 分子。在前期課題組各團隊收集的腫瘤患者標(biāo)本中，通過實時定量 RT-PCR 和原位雜交等研究所篩選的 ncRNA 表達(dá)。 另一方面，從與腫瘤治療抗性相關(guān)的蛋白質(zhì)入手，選擇對各種治療抗性起重要調(diào)控作用的因子（如 HER2、ERα，Met、EGFR 等）及其相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子（如 ATM、CHK-1,2，BRCA1、Akt， MPAK 家族等），通過系統(tǒng)地克隆其 3’UTR，并利用已經(jīng)創(chuàng)建的 ncRNA 表達(dá)庫來系統(tǒng)篩選并鑒定與上述因子關(guān)聯(lián)的新的 ncRNA。（3）腫瘤治療抗性相關(guān) ncRNA 相關(guān)蛋白的篩選和鑒定：利用前期構(gòu)建的 ncRNA的慢病毒表達(dá)載體庫，通過瞬時提高或沉默內(nèi)源性特定 ncRNA 的表達(dá)，并進(jìn)行SILAC 定量蛋白組分析，系統(tǒng)地篩查腫瘤相關(guān) ncRNA 的靶蛋白；利用 SELEX、親和層析富集和純化以及酵母三雜交系統(tǒng)等技術(shù)發(fā)現(xiàn)和鑒定此抗性過程中與這些 3-UTR 相結(jié)合的蛋白，從而進(jìn)一步探索腫瘤抗性中 ncRNA 相關(guān)蛋白的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過 Western Blot 和免疫組化等研究 ncRNA 相關(guān)蛋白的表達(dá)。（4）腫瘤治療抗性相關(guān) ncRNA 相關(guān)蛋白的功能研究：運用細(xì)胞生存和凋亡檢測研究 ncRNA 相關(guān)蛋白在過表達(dá)或者表達(dá)沉默的狀態(tài)下腫瘤細(xì)胞對治療藥物的敏感性；進(jìn)一步揭示 ncRNA 相關(guān)蛋白調(diào)控治療抗性的相關(guān)信號傳導(dǎo)通路2. 研究目標(biāo)：1）闡明非編碼 RNA 相關(guān)蛋白在腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬過程中的分子調(diào)控機理。2）揭示非編碼 RNA 相關(guān)蛋白在治療抗性中的作用機制和信號傳導(dǎo)通路。承擔(dān)單位： 中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：吳緬教授經(jīng)費比例：23.71%4.課題間相互關(guān)系本項目設(shè)置的 4 個課題分別從功能和機制兩個角度探索腫瘤特異 ncRNA 相關(guān)蛋白在惡性腫瘤自然發(fā)生發(fā)展和治療抗性中所扮演的角色。課題 1 為其它課題提供篩選與鑒定平臺，擬發(fā)現(xiàn)一批腫瘤相關(guān) ncRNA 與相關(guān)蛋白。在此基礎(chǔ)上，課題 2 則沿 ncRNA-相關(guān)蛋白 軸心向上游鑒定腫瘤 細(xì)胞內(nèi)調(diào)控 ncRNA 表達(dá)的蛋白質(zhì)及其功能，而課題 3 與 4 則分別從腫瘤發(fā)生發(fā)展和治療抗性兩個方面研究ncRNA-相關(guān)蛋白 軸心下游的功能網(wǎng) 絡(luò)。四個課題是預(yù)期目標(biāo)的四個有機組成部分，其相互關(guān)系如下圖所示：課題 1：腫瘤ncRNA 及相關(guān)蛋白篩選和鑒定平臺課題 2：調(diào)控腫瘤ncRNA 轉(zhuǎn)錄和加工修飾的相關(guān)蛋白質(zhì)功能課題 3：調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展的ncRNA 相關(guān)蛋白功能課題 4：調(diào)控腫瘤治療抗性的ncRNA 相關(guān)蛋白功能上游：調(diào)控機制下游：功能網(wǎng)絡(luò)課題設(shè)置與項目總體目標(biāo)的關(guān)系針對本項目的總體目標(biāo)，課題 1 將系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn)一批新的腫瘤 ncRNA 及相關(guān)蛋白；課題 2 將闡明腫瘤 ncRNA 轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)運、加工及修 飾過程中相關(guān)蛋白的功能；課題 3 及課題 4 將具體、深入地解析個 別具有臨床意義的 ncRNA 及其相關(guān)蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用以及 ncRNA 相關(guān)蛋白與 腫瘤治療抗性的關(guān)系。課題設(shè)置與本項目的五年預(yù)期目標(biāo)的關(guān)系1．課題 1 將建立適合于腫瘤研究的 ncRNA 相關(guān)蛋白的各種平臺，包括適合于腫瘤研究的 ncRNA 組學(xué)技術(shù)平臺，腫瘤特異 ncRNA 相互作用蛋白質(zhì)高通量篩選和分析技術(shù)平臺；建立計算生物學(xué)和實驗生物學(xué)有機結(jié)合的研究方法，系統(tǒng)分析和鑒定一批新的不同長度和不同類型腫瘤特異性 ncRNA 及相關(guān)蛋白，揭示ncRNA 及相關(guān)蛋白的相互作用機制。2．課題 2、3、4 預(yù)計將發(fā)現(xiàn) 30-40 個新的參與惡性腫瘤功能網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的ncRNA 相關(guān)蛋白，包括參與腫瘤 ncRNA 基因的 DNA 甲基化、 組蛋白修飾和轉(zhuǎn)錄，以及 腫瘤 ncRNA 轉(zhuǎn)運、加工及成熟修飾的相關(guān)蛋白；調(diào)節(jié)腫瘤啟動細(xì)胞自我增殖、多向分化，成瘤能力等生物學(xué)特性的 ncRNA 相關(guān)蛋白；調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞EMT 和抗凋亡特性，以及 腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成和治療抗性的 ncRNA 相關(guān)蛋白，為闡明惡性腫瘤 ncRNA 相關(guān)蛋白功能網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機制提供新線索。3. 課題 2、3、4 將著眼于闡明 ncRNA 相關(guān)蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展和治療抗性中的新的調(diào)控機制，包括腫瘤特異 ncRNA 相關(guān)蛋白的表 觀遺傳調(diào)控機制，ncRNA相關(guān)蛋白對腫瘤啟動細(xì)胞的調(diào)控機制，ncRNA 相關(guān)蛋白 對對腫瘤血管生成、以及腫瘤細(xì)胞遷移和 EMT 的調(diào)控機制， ncRNA 相關(guān)蛋白對腫瘤細(xì)胞凋亡、自噬和治療抗性的調(diào)控機制，深入研究 30-40 種左右具有臨床意義的非編碼 RNA 及相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)至少 2－3 條新的 ncRNA 相關(guān)蛋白參與的 調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展和治療抗性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為 人類認(rèn)識腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制和治療癌癥提供理論依據(jù)。四、年度計劃研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo)第一年1.測定常見腫瘤 ncRNA 表達(dá)譜，并進(jìn)行腫瘤啟動細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、腫瘤治療抗性相關(guān)的特異性 ncRNA及相關(guān)蛋白的系統(tǒng)篩選及鑒定。2.分離、鑒定新的受表觀遺傳學(xué)調(diào)控的非編碼 RNA3.制備納米顆粒。1. 獲 得 新 ncRNA 基 因 ，獲得常見腫瘤的 ncRNA 表達(dá)譜及腫瘤特異的 ncRNA 分子，獲得腫瘤啟動細(xì)胞ncRNA 及相關(guān)蛋白表達(dá)譜，得到腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、腫瘤治療抗性相關(guān)的ncRNA 及相關(guān)蛋白候選分子。2. 篩選出一批新的受表觀遺傳調(diào)控的腫瘤非編碼 RNA 及相關(guān)蛋白。3.制備出相關(guān)納米顆粒并獲得表征數(shù)據(jù)；獲得一到兩種納米顆粒處理后有顯著表達(dá)量變化的 ncRNA。4. 在 SCI 期 刊 發(fā) 表 論 文 7-11 篇 ，其 中 IF>5 的 論 文 2-4 篇 。研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo)第二年1. 篩選、鑒定腫瘤特異性 ncRNA 相互作用候選蛋白質(zhì)。2. 篩選受甲基化調(diào)控的非編碼RNA,研究組蛋白修飾對 ncRNA 的調(diào)控作用。3. 在腫瘤啟動細(xì)胞血管生成模型中篩選及鑒定與腫瘤血管生成相關(guān)的ncRNA 及相關(guān)蛋白，構(gòu)建 ncRNA表達(dá)載體并分析 ncRNA 調(diào)控的下游蛋白。4. 研究納米顆粒處理后有顯著表達(dá)量變化的 ncRNA 的表達(dá)模式差異，并驗證其在細(xì)胞自噬中發(fā)生的作用并研究其作用機理；鑒定治療抗性相關(guān) ncRNA 的靶基因蛋白。1. 得到腫瘤特異性 ncRNA 相互作用蛋白。2. 得到受甲基化調(diào)控的非編碼RNA,明確組蛋白修飾對 ncRNA 的調(diào)控作用。3.篩選出腫瘤血管生成相關(guān)ncRNA，完成 ncRNA 及相關(guān)蛋白的載體構(gòu)建4. 闡明納米顆粒處理后有顯著表達(dá)量變化的 ncRNA 在細(xì)胞自噬中所起的作用；得到治療抗性相關(guān)ncRNA 的靶基因蛋白。5. 在 SCI 期 刊 發(fā) 表 論 文 18-21 篇 ，其 中 IF>5 的 論 文 6-12 篇 。第三年1.結(jié)合計算生物學(xué)的分析結(jié)果，采用規(guī)?；芯康鞍踪|(zhì)與 RNA 相互作用技術(shù)在細(xì)胞內(nèi)外探索 ncRNA 與蛋白質(zhì)相互作用，揭示蛋白質(zhì)-ncRNA 的相互作用方式。1.確認(rèn)腫瘤特異 ncRNA 相互作用蛋白在腫瘤中的表達(dá)變化。發(fā)現(xiàn)ncRNA 與蛋白質(zhì)相互作用的序列和結(jié)構(gòu)規(guī)律。2. 獲得腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（如 c-研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo)2. 篩選調(diào)控 腫瘤相關(guān)非 編碼 RNA轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，鑒定轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的啟動子區(qū)域。從蛋白庫中篩選啟動子特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，并探討其功能。3. 進(jìn)行 ncRNA 及相關(guān)蛋白在調(diào)節(jié)腫瘤啟動細(xì)胞生物學(xué)功能的研究。4. 篩選能誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬發(fā)生或者能抑制饑餓引發(fā)之自噬的 ncRNA，探索幾個 ncRNA 對腫瘤治療抗性的作用機制。myc、P53 等）調(diào)控的 ncRNA 轉(zhuǎn)錄譜以及轉(zhuǎn)錄因子的啟動子結(jié)合譜。3. 完成 ncRNA 及相關(guān)蛋白調(diào)控腫瘤啟動細(xì)胞生物學(xué)功能的研究。4.鑒定出一到兩種能誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬發(fā)生或者能抑制饑餓引發(fā)之自噬的 ncRNA 并鑒定其靶蛋白；完成 1-2 個非編碼 RNA 調(diào)節(jié)腫瘤治療抗性的研究。在 SCI 期 刊 發(fā) 表 論 文 10-16 篇 ，其 中 IF>5 的 論 文 6-10 篇 。第四年1. 對腫瘤相關(guān) ncRNA 的表達(dá)進(jìn)行定位和定性分析，采用過表達(dá)及報告基因技術(shù)系統(tǒng)篩查腫瘤相關(guān)miRNA 的靶基因。2. 對腫瘤非 編碼 RNA 的轉(zhuǎn)錄后加工酶系的表達(dá)進(jìn)行定位、定性及定量檢測。篩查新的 ncRNA 轉(zhuǎn)錄后加工相關(guān)的蛋白，并分析其功能。1.確認(rèn)腫瘤相關(guān) ncRNA 在腫瘤中的表達(dá)變化。系統(tǒng)地獲得腫瘤相關(guān)miRNA 的調(diào)節(jié)譜。2. 探明部分腫瘤相關(guān) ncRNA 成熟后的修飾及降解的機制。篩選出調(diào)控轉(zhuǎn)錄后加工關(guān)鍵蛋白的 miRNA。3. 完成 ncRNA 調(diào)控腫瘤細(xì)胞侵襲、研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo)3. 在腫瘤轉(zhuǎn)移模型中探索 ncRNA及相關(guān)蛋白影響腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的作用。4. 研究能誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬發(fā)生或者能抑制饑餓引發(fā)之自噬的 ncRNA在細(xì)胞自噬中所起的作用，并研究其靶蛋白在細(xì)胞自噬中的作用轉(zhuǎn)移能力的作用研究。4. 闡明能抑制饑餓引發(fā)之自噬的ncRNA 在自噬這一生物學(xué)過程中的具體作用5.在 SCI 期 刊 發(fā) 表 論 文 10-16 篇 ，其 中 IF>5 的 論 文 6-10 篇 。研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo)第五年1.結(jié)合表達(dá)譜篩選數(shù)據(jù)，對系統(tǒng)篩查的腫瘤相關(guān) ncRNA 及相互作用蛋白的角色即癌基因/抑癌基因進(jìn)行確認(rèn)，進(jìn)行初步功能分析。2. 應(yīng)用惡性腫瘤相關(guān) ncRNA 啟動子區(qū)域作為誘餌從蛋白質(zhì)庫中篩選與其特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，并應(yīng)用miRNAs 表達(dá) 庫篩選與關(guān) 鍵作用蛋白相關(guān)的 miRNAs。 3. 在腫瘤啟動細(xì)胞血管分化模型中研究 ncRNA 及相關(guān)蛋白的調(diào)控作用，探索 ncRNA 及相關(guān)蛋白對腫瘤血管生成作用的調(diào)節(jié)。4. 研究 ncRNA 生成過程中的重要蛋白質(zhì)如 Drosha、Dicer 以及Argonaute 2 在細(xì)胞自噬過程中亞細(xì)胞定位可能發(fā)生的變化?？偨Y(jié)相關(guān)研究1. 完成腫瘤非編碼 RNA 及其相互作用蛋白的系統(tǒng)識別與機制研究。2.完成惡性腫瘤 ncRNA 相關(guān)蛋白對 ncRNA 表達(dá)的轉(zhuǎn)錄、 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的研究。3.完成 ncRNA 及相關(guān)蛋白調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展的研究。4.完成 ncRNA 及相關(guān)蛋白調(diào)控腫瘤治療抗性及調(diào)節(jié)自噬的研究。5. 在 SCI 期 刊 發(fā) 表 論 文 12-17 篇 ，其 中 IF>5 的 論 文 8-12 篇 。