【基金標(biāo)書】2010CB912600-內(nèi)源性代謝產(chǎn)物硫化氫與介導(dǎo)心臟生理與病理機(jī)制的蛋白質(zhì)靶分子的相互作用及其機(jī)制

《【基金標(biāo)書】2010CB912600-內(nèi)源性代謝產(chǎn)物硫化氫與介導(dǎo)心臟生理與病理機(jī)制的蛋白質(zhì)靶分子的相互作用及其機(jī)制》由會員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《【基金標(biāo)書】2010CB912600-內(nèi)源性代謝產(chǎn)物硫化氫與介導(dǎo)心臟生理與病理機(jī)制的蛋白質(zhì)靶分子的相互作用及其機(jī)制（18頁珍藏版）》請在裝配圖網(wǎng)上搜索。

項目名稱： 內(nèi)源性代謝產(chǎn)物硫化氫與介導(dǎo)心臟生理與病理機(jī)制的蛋白質(zhì)靶分子的相互作用及其機(jī)制首席科學(xué)家： 朱依諄 復(fù)旦大學(xué)起止年限： 2010 年 1 月-2014 年 8 月依托部門： 教育部 上海市科委一、研究內(nèi)容綜合應(yīng)用代謝組學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)等方法和技術(shù)，以重要的心血管生理和病理調(diào)控通路為研究主要對象，研究硫 化 氫 與蛋白 質(zhì)靶分子的相互作用及其機(jī)制；研究硫 化 氫 對 蛋白之間、蛋白 質(zhì)和核酸之間相互作用的調(diào)節(jié) 及其機(jī)制。 闡明心臟中內(nèi)源性硫 化 氫 在生理和病理情況下的生成代謝途徑，探討硫 化 氫 的分解代謝過程。1. 揭示若干 H2S 調(diào)控跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)的重要通路；發(fā)現(xiàn)若干 H2S 直接作用的靶分子；明確H2S 與靶分子蛋白相互作用的分子機(jī)制。2. 分離和驗(yàn)證 H2S 細(xì)胞效應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖和凋亡過程中信號通路中的重要蛋白因子，結(jié)合基因組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué), 生物化學(xué)和分子生物學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示 H2S 細(xì)胞效 應(yīng)的分子機(jī)制和重要蛋白的作用機(jī)理和生物學(xué)功能。3. 應(yīng)用獨(dú)創(chuàng)的半胱氨酸衍生物 SPRC 可作為分子探針，全面揭示含硫氨基酸體內(nèi)代謝的基本規(guī)律。篩選出與含硫氨基酸及探 針?biāo)幬?SPRC 的心肌缺血保護(hù)作用密切相關(guān)蛋白分子，并對其功能進(jìn)行研究，探尋含硫氨基酸及探 針?biāo)幬锷飳W(xué)效 應(yīng)和代謝通路的機(jī)體內(nèi)源性拮抗劑和抑制劑，可能是具有臨 床應(yīng)用前景的防治心血管疾病的新策略。4. 闡明心臟中 CSE 途徑和 ATT/MST 途徑的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及兩條途徑的協(xié)調(diào)機(jī)制。闡明CSE 在生理條件和病理條件下表達(dá)調(diào)控的實(shí)時監(jiān)測和在體研究，同時對闡明 CSE 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也非常重要。闡明 H2S 跨膜傳遞及與氧化性小分子和金屬離子的反應(yīng)特性。H 2S 的跨膜傳遞關(guān)系到內(nèi)源性 H2S 的作用方式以及外源性 H2S 或 H2S 供體作 為藥物的可行性；與氧化性小分子和與金屬離子的反應(yīng)特性則與 H2S 的分解代謝相關(guān)。二、預(yù)期目標(biāo)（一）總體目標(biāo)采用蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)的經(jīng)典研究方法， 結(jié)合心血管疾病的生理和病理 過程，從 細(xì)胞水平到整體水平進(jìn)行動態(tài)研究。以缺血性心 臟病為核心，探討體內(nèi)活性代謝產(chǎn)物小分子氣體信號-H 2S 對心血管系統(tǒng)保護(hù) 作用的分子機(jī)制，篩選分離出特異的靶蛋白、目標(biāo)基因和生物標(biāo)記物；進(jìn)一步利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)，生物化學(xué)的方法研究蛋白之 間，蛋白和 DNA，RNA 的相互作用機(jī)理。全面闡述心臟中內(nèi)源性 H2S 在生理和病理情況下的生成代謝途徑，以及生成的內(nèi)源性 H2S 在細(xì)胞內(nèi)和 細(xì)胞間的傳遞過程以及傳遞過程中與氧化性小分子（如 NO，H2O2）及金屬離子的相互作用，從而探討 H2S 的分解代謝過程。（二）五年預(yù)期目標(biāo)1. 闡 明 H2S 在 細(xì) 胞 水 平 上 的 傳 遞 過 程 ，探 討 H2S 傳 遞 機(jī) 制 及 傳 遞 過 程 中 參 與 的 反應(yīng) ，如 H2S 對氧化 應(yīng)激蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的構(gòu)象和正常功能的影響。該工作可能找到體內(nèi) H2S 新的作用靶分子，從而為最終闡明 H2S 對心臟保護(hù)作用的機(jī)制提供理論依據(jù)；2. 闡明 H2S 傳 遞 機(jī) 制 及 傳 遞 過 程 中 蛋白之間，蛋白和 DNA，RNA 的相互作用機(jī)理，為在哺乳動物中揭示 H2S 細(xì)胞效應(yīng)的分子機(jī)制和闡明 H2S 在生理病理上的作用提供理論依據(jù)；3. 細(xì)胞水平和整體水平上研究內(nèi)源性 H2S 產(chǎn)生相關(guān)酶 CSE 在應(yīng)激條件下（如氧化壓力）和病理狀態(tài)下表達(dá)調(diào)控的機(jī)理，找到相關(guān) 轉(zhuǎn)錄因子及激活這 些轉(zhuǎn)錄因子的信號通路和相關(guān)蛋白分子，為設(shè)計激活體內(nèi)內(nèi)源性 H2S 產(chǎn)生的藥物打下基礎(chǔ)；4. 培養(yǎng)一批國際一流心臟蛋白組學(xué)領(lǐng)域科研人員，培養(yǎng)一批高水平的中青年科學(xué)家，提高我國蛋白組學(xué)科研水平和自主創(chuàng)新能力，增 強(qiáng)國際競爭力。5. 研究成果將以論文形式表現(xiàn)，發(fā)表高水平論文 20~30 篇（其中 5~10 篇 IF>10），申 請10~15 項發(fā)明專利。三、研究方案（一）課題總體思路鑒于目前蛋白質(zhì)組研究比較多地側(cè)重于蛋白質(zhì)表達(dá)譜的研究上，對于在重要生理、病理過程中調(diào)控通路的蛋白質(zhì)間的相互作用的研究有待深入研究。此外，蛋白質(zhì)是在有機(jī)體內(nèi)發(fā)揮生理功能的；而機(jī)體內(nèi)存在著眾多可與蛋白質(zhì)結(jié)合的小分子物質(zhì)，其中包括代謝產(chǎn)物。內(nèi)源性代謝產(chǎn)物可能和蛋白質(zhì)結(jié)合，從而改 變蛋白質(zhì)分子的空 間構(gòu)象和功能。因此，研究內(nèi)源性代謝產(chǎn)物對蛋白質(zhì)組的作用是進(jìn)一步了解蛋白質(zhì)在活體的功能是至關(guān)重要的，尤其是如能發(fā)現(xiàn)可直接與代謝產(chǎn)物發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)，不但 對 于了解重要的生理、病理 調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要的科學(xué)意義，而且也將有助于蛋白 質(zhì)學(xué)的研究更加深入，更有望了解各重要生理、病理過程的機(jī)制；有望形成蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個分支，即小分子活性物 質(zhì)對蛋白質(zhì)大分子結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)控。H 2S 是最近幾年開始引起國內(nèi)外學(xué)術(shù)界注意的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物?？傮w來講國內(nèi)外對該領(lǐng)域的研究尚處于起步階段。通 過本課題的研究，有望分析 H2S 與蛋白質(zhì)之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)相互作用的基本 規(guī)律，揭示 H2S 調(diào)控若干重要心血管生理、病理過程的機(jī)制。其研究成果還有望對于蛋白 質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展作出一定的 貢獻(xiàn)。（二）課題的特色和創(chuàng)新點(diǎn)心臟離子通道功能調(diào)節(jié)和血管新生是調(diào)節(jié)心臟生理功能和心臟缺血等疾病的重要調(diào)控通路，本課題組于 2007 年和 2008 年分別發(fā)現(xiàn)了 H2S 對上述兩條心血管通路的調(diào)節(jié)作用。本課題組發(fā)現(xiàn)在心肌細(xì)胞中，H 2S 抑制心肌細(xì)胞膜 L 型 Ca2+通道的開放；在內(nèi)皮細(xì)胞中，H 2S促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、管腔形成以及在整體模型中的血管新生。但是 H2S 產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的機(jī)制未被闡明，尤其是 H2S 直接作用的靶分子至今不明。本 項目在前期工作的基礎(chǔ)上， 推定H2S 直接作用的靶分子在心肌細(xì)胞是調(diào)控跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)的 Ca2+離子通道，或與其相偶連的信號分子；在內(nèi)皮細(xì)胞直接作用于 VEGFR2，或 PI3K→Akt→HIF-1→ 生存素信號通路中的信號分子，在此有限范圍中尋 找 H2S 直接作用的靶分子。如能取得成功，對于揭示 H2S 這樣一個小分子物質(zhì)是如何調(diào)控大分子（靶蛋白）的空間構(gòu)象和功能的具有重要的科學(xué)意義，可能會發(fā)現(xiàn)一種蛋白功能調(diào)控的新規(guī)律。首次應(yīng)用代謝組學(xué)方法系統(tǒng)研究含硫氨基酸及其衍生物包括：半胱氨酸、甲硫氨酸、SAC、SPRC 等在體內(nèi)的代謝 途徑，包括 H2S 及有關(guān)中間代謝產(chǎn)物。此外，針對缺血、缺氧性心臟疾病，特別是含硫氨基酸及 探針?biāo)幬?SPRC 進(jìn)行生物化學(xué)，結(jié)構(gòu)研究和代謝功能的研究，及上述代謝途徑的變化。在此基 礎(chǔ)上， 篩選和優(yōu)化具有治療 前景的可以生成內(nèi)源性 H2S 的化合物，并進(jìn)行合理的結(jié)構(gòu)改造。項目涉及的領(lǐng)域和技術(shù)非常多，預(yù)期在缺血、缺氧性心臟疾病的基礎(chǔ)研究、臨床治療和醫(yī) 藥開發(fā)方面取得突破性進(jìn)展。首次通過裂殖酵母模式生物的基因組學(xué)和蛋白組學(xué)重點(diǎn)研究 H2S 對細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖和凋亡過程中信號通路的影響， 結(jié)合用釀酒酵母的突變 體庫的篩選分離出 H2S 細(xì)胞效應(yīng)信號傳導(dǎo)通路中的多個重要蛋白因子，找到這些重要蛋白因子在大鼠心肌 細(xì)胞中的同源蛋白，進(jìn)一步利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)，生物化學(xué)的方法研究蛋白之 間 ，蛋白和 DNA，RNA 的相互作用機(jī)理，結(jié)合基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組 學(xué), 生物化學(xué)和分子生物學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)的結(jié)果，揭示H2S 細(xì)胞效應(yīng)的分子機(jī)制 ，闡 明 H2S 在生理病理上的作用為新藥設(shè)計及許多疾病的治療提供新的思路。通過轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)構(gòu)建攜帶 CSE 啟動子控制的報告基因的 轉(zhuǎn)基因小鼠，從而在整體水平上實(shí)現(xiàn)對心臟中內(nèi)源性 H2S 產(chǎn)生相關(guān)酶 CSE 在生理條件和病理條件下表達(dá)調(diào)控的實(shí)時觀測和在體研究。闡明生理和病理條件下心 臟內(nèi)源性 H2S 產(chǎn)生的調(diào)控機(jī)制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為通過藥物干預(yù)心臟內(nèi)源性 H2S 的 產(chǎn)生奠定基礎(chǔ)。 闡明體內(nèi) H2S 的傳遞途徑及其作用的小分子，從而探討 H2S 的分解代謝途徑。利用轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對 CSE 表達(dá)的實(shí)時監(jiān)測和在體研究。同時研究心臟內(nèi)源性 H2S 產(chǎn)生的兩條途徑，既 闡明各自的 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)又研究兩條途徑之間的關(guān)聯(lián)。既研究生理條件下內(nèi)源性 H2S 產(chǎn)生的調(diào)控機(jī)制，又強(qiáng)調(diào)缺血、缺氧等病理條件下調(diào)控機(jī)制的變化。研究 H2S 與 細(xì)胞內(nèi)氧化性小分子和金屬離子的反應(yīng)特性，探討內(nèi)源性 H2S的分解代謝。（三）課題設(shè)置課題 1. 內(nèi)源性代謝產(chǎn)物 H2S 對心臟細(xì)胞離子通道和血管新生通路的 調(diào)控機(jī)制主要研究內(nèi)容：離子通道和血管新生是與心臟生理、病理疾病密切相關(guān)的兩條重要 調(diào)節(jié)通路。本 課題組首先發(fā)現(xiàn) H2S 可影響上述兩條重要調(diào)控通路，并在前期研究中率先發(fā)現(xiàn) H2S 可抑制心肌細(xì)胞膜上 L 型 Ca2+通道的開放；可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、形成新的血管。在此基礎(chǔ)上，我們擬深入研究 H2S 調(diào)控 L 型 Ca2+通道與促血管新生的分子機(jī)制，確定 H2S 作用的關(guān)鍵靶蛋白，闡明其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為通過 H2S 途徑干預(yù)心臟病打下基礎(chǔ)。研究目標(biāo)：1. 揭示若干 H2S 調(diào)控跨膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)的重要通路，找到若干 H2S 直接作用的靶分子，深入研究 H2S 對其的 調(diào)控機(jī)制。2. 找到 H2S 調(diào)控血管新生的直接作用靶點(diǎn)，深入研究 H2S 的調(diào)控血管新生機(jī)制。3. 發(fā)現(xiàn) H2S 在不同靶分子蛋白上共同的可結(jié)合的位點(diǎn)或共有的化學(xué)修飾方式。課題承擔(dān)單位：復(fù)旦大學(xué)；上海理工大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：朱依純 教授課題參加人員：王睿、錢睿哲、付偉、盧寧、蔡文杰、王文 偉經(jīng)費(fèi)比例：23％課題 2. H2S 對 真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)譜、蛋白 間相互作用以及蛋白與核酸的相互作用的調(diào)控主要研究內(nèi)容：H2S 是最近發(fā)現(xiàn) 的內(nèi)源性信號分子，對細(xì)胞具有獨(dú)特的調(diào)控作用。本課題以酵母為模式生物，通過基因組學(xué)和蛋白組 學(xué)的方法， 闡明 H2S 影響細(xì) 胞周期、 細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的信號通路，確定 H2S 作用的重要靶分子，繪制一幅完整的 H2S 細(xì)胞效應(yīng)的信號通路圖。將酵母中的研究結(jié)果進(jìn)一步到心肌細(xì)胞加以驗(yàn)證。該工作有望全面系 統(tǒng)的闡明 H2S 細(xì)胞效應(yīng)的分子機(jī)制與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為通過 H2S 途徑干預(yù)重大疾病找到新的靶點(diǎn)。研究目標(biāo)：結(jié)合基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué), 生物化學(xué)和分子生物學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)的結(jié)果在裂殖酵母中繪制一幅完整的 H2S 細(xì)胞效 應(yīng)得信號傳導(dǎo)通路圖。 分離出多個參與細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖和凋亡過程中信號通路中的重要蛋白因子，重點(diǎn)研究重要蛋白因子在各個信號通路中的作用機(jī)理，揭示 H2S 細(xì)胞效應(yīng)的分子機(jī)制，為在哺乳動物中 揭示 H2S 細(xì)胞效應(yīng)的分子機(jī)制和闡明 H2S 在生理病理上的作用提供巨大的幫助和奠定基礎(chǔ)。課題承擔(dān)單位：復(fù)旦大學(xué)；南開大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：Alastair Murchie 教授課題參加人員：陳東戎、Mark Gerrard Bartlam、王哲、王 銘潔、霍克克經(jīng)費(fèi)比例：20％課題 3. 含硫氨基酸及其衍生物對心臟作用靶點(diǎn)及代謝途徑研究主要研究內(nèi)容：體內(nèi)含硫氨基酸及從食物中攝入的含硫化合物通過酶的作用分解代謝產(chǎn)生 H2S，心臟中產(chǎn)生 H2S 的關(guān) 鍵酶是 CSE。本課題首次發(fā)現(xiàn)半胱氨酸衍生物 SAC 通過促進(jìn) H2S 生成而具有心血管保護(hù)作用。我們進(jìn)一步合成了具有自主知 識產(chǎn)權(quán)的半胱氨酸衍生物 SPRC，其具有更好的心血管保護(hù)作用。在此基 礎(chǔ)上，我 們擬通過代謝組學(xué)的方法，全面揭示含硫氨基酸及其衍生物（如 SPRC）在體內(nèi)的代謝規(guī)律，確定與含硫氨基酸及探針?biāo)幬?SPRC 心臟保護(hù)作用密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，并對其功能 進(jìn)行深入研究。 設(shè)計、優(yōu)化、合成更好的具有藥用前景的H2S 供體化合物， 為 H2S 供體藥物的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。研究目標(biāo)：1. 闡明 SPRC 對心肌缺血保護(hù)作用的分子機(jī)制，鑒定出其作用的關(guān)鍵蛋白，揭示其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。2. 進(jìn)一步優(yōu)化 SPRC 的結(jié)構(gòu)，設(shè)計合成出具有更好心肌保護(hù)作用的 H2S 供體化合物，為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。3. 闡明含硫氨基酸和 SPRC 在體內(nèi)的代謝途徑，確定其代謝的關(guān)鍵酶，建立體內(nèi)含硫氨基酸代謝途徑研究的關(guān)鍵技術(shù)。4. 闡明缺血、缺氧病理條件下 SPRC 對心肌保護(hù)作用的機(jī)制和經(jīng)由 CSE 的代謝途徑， 鑒定出其影響的關(guān)鍵蛋白質(zhì)和信號通路，揭示 SPRC 對 CSE 是否具有反饋調(diào)節(jié)作用，從而發(fā)現(xiàn)干預(yù)心臟疾病病的全新靶蛋白。課題承擔(dān)單位：復(fù)旦大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：朱依諄 教授學(xué)術(shù)骨干：郭薇、林國強(qiáng)、儲以微、趙偉利、孫遜、魏邦國、古險峰經(jīng)費(fèi)比例：34％課題 4. 心肌中局部內(nèi)源性 H2S 生成調(diào)控及傳遞主要研究內(nèi)容：以小鼠為模式動物，綜合運(yùn)用基因 組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，著重研究已知的心臟中內(nèi)源性 H2S 的生成關(guān) 鍵酶 CSE 在心臟生理和病理條件下的表達(dá)調(diào)控， 闡明其信號通路和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本課題同時研究 AAT 途徑在心臟內(nèi)源性 H2S 產(chǎn)生中的作用及在心臟生理和病理過程中的表達(dá)調(diào)控。本課題還將研究內(nèi)源性 H2S 在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的傳遞及傳遞過程中與氧化性小分子及金屬離子的相互作用，探討其在體內(nèi)的代謝途徑。研究目標(biāo)：1. 構(gòu)建攜帶 CSE 啟動子控制的報告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，在整體水平上實(shí)現(xiàn)在生理條件下和病理條件下對 CSE 表達(dá)調(diào)控的實(shí)時觀測和在體研究。2. 通過生物信息學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)和生物物理的方法闡明生理條件和病理條件下 CSE 表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制， 闡明調(diào)控的信號網(wǎng)絡(luò)。3. 闡明 ATT/MST 途徑在心 臟生病理條件下表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，及其對心臟內(nèi)源性 H2S 產(chǎn)生的作用。4. 闡明 H2S 在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的傳遞過程，以及傳遞過程中與氧化性小分子和金屬離子的反應(yīng)特性。課題承擔(dān)單位：同濟(jì)大學(xué)；復(fù)旦大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：郭占云 研究員學(xué)術(shù)骨干：查錫良、郜洪文、楊奕清、孫曉宇、邵 曉霞、朱融融、吳玲玲 博士后經(jīng)費(fèi)比例：23%（四）課題技術(shù)路線（五）各課題關(guān)系：本項目為確保參加單位分工協(xié)作、 優(yōu)勢互補(bǔ)，在明確合作方式的基礎(chǔ)上，加強(qiáng)與課題組核心單位以外的其它在學(xué)科、 資源、技 術(shù)及人才方面有優(yōu)勢 的實(shí)驗(yàn)室協(xié)作，并吸收優(yōu)秀人才以個人所在實(shí)驗(yàn)室身份加入到對口的課題承擔(dān)單位負(fù)責(zé)或參加本課題研究，以保證科研隊伍組成的最佳化。實(shí)現(xiàn)技術(shù)平臺共用、科研資源共享，研究目標(biāo)集中、點(diǎn)面結(jié)合及研究內(nèi)容緊密銜接等組織形式。同時，課題實(shí)行 2＋3 的滾動制，制訂課題完成質(zhì)量的定量考核標(biāo)準(zhǔn)，半年和一年分別進(jìn)行一次研究進(jìn)度考核。完成不好的 課題 將減少科研經(jīng)費(fèi)，完成好的 課題將增加科研經(jīng)費(fèi)。2 年完成不好的 單位和個人承擔(dān)的課題將被取消，重新吸收新的課題組進(jìn)行本課題的研究或?qū)⒔?jīng)費(fèi)集中到其它有望獲得較大突破的課題。為保證項目的順利完成及與其它“973”項目的無縫銜接，項目將聘請國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域的著名專家，特別是“973”相關(guān)領(lǐng) 域的首席科學(xué)家，擔(dān)任本項目的學(xué)術(shù)顧問并成立相應(yīng)的顧問委員會，監(jiān)督本項目的實(shí)施，參與本項目的管理并提出合理化建 議。本項目第一子課題的研究方案針對 H2S 對心肌細(xì)胞離子通道的調(diào)控和 H2S 促血管新生作用的兩條重要生理、病理通路，結(jié)合內(nèi)源性代謝產(chǎn)物對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行調(diào)控形成，盡管上述研究可使我們在明確的生理、病理通路中研究 H2S 對蛋白質(zhì)靶分子結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)機(jī)制，但其局限性也是勿庸置疑的。H 2S 很可能還有在上述兩條通路以外的靶蛋白，并由此再間接地影響上述通路。因此，還必須同時在更廣的范圍內(nèi)尋找 H2S 的靶蛋白，以便發(fā)現(xiàn) H2S 與靶蛋白 結(jié)合的共同規(guī) 律；還要應(yīng)用基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，觀察 H2S 是否還能通過調(diào)控基因表達(dá)而使細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜發(fā)生變化，并分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)，以及蛋白 質(zhì)與核酸間的相互作用。這部分研究將構(gòu)成第二子 課題的主要研究方案。第二子課題研究中所得到的較全面的關(guān)于 H2S 調(diào)節(jié) 基因表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)譜的研究結(jié)果，將為第一子課題的研究提供更全面的信息。另一方面，第一子課題中關(guān)于 H2S 對于特定蛋白靶分子及其相互作用的研究結(jié)果，將有助于分析第二子 課題中觀察到的蛋白質(zhì) 和基因表達(dá)譜的諸多變化，有助于分析上述變化中基因表達(dá)產(chǎn)物之間的相互關(guān)系， 繼而可據(jù)此通 過基因敲除等方法確認(rèn)上述因果關(guān)系。因此，通過第一和第二子課題在研究過程中的互動，綜合應(yīng)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)和生理、病理學(xué)研究方法，既在由本課題組首先發(fā)現(xiàn)的兩條重要心血管調(diào)控通路中有的放矢地研究 H2S 對靶蛋白分子空間結(jié)構(gòu)和動能的調(diào)控及其生理、病理學(xué)意義，又能全面地反映 H2S 對心臟蛋白 質(zhì)表達(dá)譜的影響，通過學(xué)科交叉的互補(bǔ)作用，使 H2S 對重要心血管信號通路的調(diào)控作用及其機(jī)制得到較完整、深入的解答。鑒于 H2S 是一種具有心血管 調(diào)節(jié)功能的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，其體內(nèi)代謝過程值得研究。H2S 是由體內(nèi)含硫氨基酸（半胱氨酸、甲硫氨酸）作 為底物代謝產(chǎn)生的。但是，上述 H2S 底物對體內(nèi) H2S 生成的作用及其機(jī)制仍有待闡明，尤其是其組織特異性的作用，如在心臟中對局部 H2S 生成的 調(diào)節(jié)作用至今不明。因此本項目第三子課題擬應(yīng)用代謝組學(xué)方法研究含硫氨基酸及其衍生物的體內(nèi)代謝過程，研究其 對內(nèi)源性 H2S 產(chǎn)生的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。此外，還將以本課題組特有的含硫氨基酸衍生物 SPRC 為分子探針，通過研究其為何具有獨(dú)特的調(diào)節(jié) H2S 體內(nèi)代 謝的作用，剖析含硫氨基酸在體內(nèi)的代謝過程。此外，由于 H2S 在體內(nèi)的半衰期極短；而其最重要的調(diào)節(jié)作用又發(fā)生在心血管系統(tǒng)，對于 H2S 的心臟 效應(yīng)來說，局部生成的 H2S 可能發(fā)揮更重要的調(diào)節(jié)作用。因此，本項目中還將設(shè)置子課題四，重點(diǎn)研究心肌局部 H2S 生成的調(diào)節(jié)機(jī)制。子課題四同時研究心肌缺血、缺氧等病理狀態(tài)下心肌局部 H2S 生成的代謝途徑，可能發(fā)現(xiàn)新的生成 H2S 的代謝途徑。因此，子課題三是在整體水平上地 應(yīng)用代謝組學(xué)的方法系 統(tǒng)地研究含硫氨基酸及其衍生物的代謝途徑，除了 H2S 的生成外，還觀察所有相關(guān)中 間產(chǎn)物的生成，可望 對內(nèi)源性 H2S生成的代謝途徑有一個全面系統(tǒng)的認(rèn)識。而子 課題四則在此基 礎(chǔ)上重點(diǎn)研究心肌局部的H2S 生成及其調(diào) 控機(jī)制，使關(guān)于內(nèi)源性 H2S 代謝的認(rèn)識進(jìn)一步得到深入。事實(shí)上，子 課題三、四中調(diào)控 H2S 生成的關(guān)鍵因子 -有關(guān)代謝途徑的確都是蛋白 質(zhì)。因此，子 課題三、四的研究也可認(rèn)為是關(guān)于蛋白質(zhì)對 H2S 作用的研究。而子課題一、二則屬于 H2S 對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的調(diào)節(jié)作用。通過上述四個子課題的研究，可分析 H2S 與蛋白質(zhì)之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)相互作用的基本規(guī)律，揭示 H2S 調(diào)控若干重要心血管生理、病理 過程的機(jī)制。其研究成果還有望對于蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展作出一定的貢獻(xiàn)。四、年度計劃2010 年 1 月至 2010 年 12 月1. 研究內(nèi)容1）在心肌細(xì)胞中研究 PKA 和 PKG 在介導(dǎo) H2S/HS-對 L 型 Ca2+通道抑制效應(yīng)中的作用；闡明 PKA 和 PKG 是否為 H2S/HS-在心肌細(xì)胞中的靶分子。2）研究在血管內(nèi)皮細(xì)胞中是否存在 PI3K→Akt→Hif-1→生存素通路，并研究這一通路分別與血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移以及管腔形成的關(guān)系。3）用裂殖酵母生物芯片對比在細(xì)胞內(nèi)有 H2S 和沒有 H2S 的條件下全基因組基因的表達(dá)譜的差異；4）在釀酒酵母中全基因組基因敲除的文庫和全基因組基因基因過表達(dá)的文庫，對比在細(xì)胞內(nèi)有 H2S 和沒有 H2S 的條件下 釀酒酵母生長情況。5）闡明 SPRC 通 過何種機(jī)制產(chǎn)生心肌缺血保護(hù)的作用；SPRC 及其衍生物對 CSE 是否具有反饋調(diào)節(jié)作用；SPRC 對缺血、缺氧狀態(tài)下原代培養(yǎng)心室肌細(xì)胞的比較蛋白組學(xué)研究。6）明確 SPRC 在體內(nèi)的代 謝途徑，在腎臟及肝臟中的代謝，完成動物實(shí)驗(yàn)。7）克隆 CSE 的調(diào)控區(qū)，構(gòu)建用于 轉(zhuǎn)基因小鼠的表達(dá)載體；通 過顯微注射的方法構(gòu)建攜帶CSE 啟動子控制的報告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠；培養(yǎng)心肌細(xì)胞，通過 RNA 干擾抑制 CSE 的表達(dá)。并建立測定體內(nèi) H2S、氧化性小分子和金屬離子的方法。2. 預(yù)期目標(biāo)1）闡明 PKA 和 PKG 是否為 H2S/HS-在心肌細(xì)胞中的靶分子。2）闡明 PI3K→Akt→Hif-1→生存素通路對血管新生的影響。3）利用在釀酒酵母中所得結(jié)果對比， 補(bǔ)充和證實(shí)裂殖酵母在基因 組學(xué)和蛋白組學(xué)所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，闡明在細(xì)胞內(nèi)有 H2S 和沒有 H2S 的條件下釀酒酵母生長情況；4）構(gòu)建出 CSE 啟動子- 報告基因載體；初步得到攜帶 CSE 啟動子控制的報告基因的轉(zhuǎn)基因小鼠；建立小鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)體系，確定 RNA 干擾可以抑制 CSE 的表達(dá)；建立起測定體內(nèi)H2S、氧化性小分子和金屬離子的方法。5）闡明 SPRC 對 心肌缺血時線粒體 KATP、KCa 和 PTP 離子通道的影響及其抗氧化作用關(guān)鍵蛋白 SOD 和 CAT 影響。6）揭示 SPRC 在體內(nèi) 釋放 H2S 的過程及在體內(nèi)的代謝途徑，找出其代謝過程中的關(guān)鍵酶。7）發(fā)表 SCI 論文 7 篇以上，申 請專利 1～2 項。8）培養(yǎng)研究生（博士生，碩士生） 25 名以上。2011 年 1 月至 2011 年 12 月1. 研究內(nèi)容1）研究 H2S/HS-在靶分子（PKA/PKG）上的結(jié)合位點(diǎn)， 結(jié)合后靶分子空 間構(gòu)象的變化與其功能之間的關(guān)系。2）研究 Hif-1 是否還存在生存素非依賴的通路（如 VEGF）。3) 利用雙向電 泳和質(zhì)譜的方法，對比在細(xì)胞內(nèi)有硫化氫和沒有硫化氫的條件下全基因組蛋白表達(dá)譜的差異。4）通過計算機(jī)模擬對 SPRC 與 CSE 的相互作用進(jìn)行了初步研究。分析 CSE 活性位點(diǎn)的化學(xué)性質(zhì)，在設(shè)計中引入羥基，肼基，羧基，胍基， 脲基，羥胺基等極性基團(tuán)以加強(qiáng)與 CSE 的親合性，進(jìn)行活性篩選。5）通過生物信息學(xué)、CHIP 、DNA 親和層析等方法預(yù)測并分離純化調(diào)控 CSE 的轉(zhuǎn)錄因子；篩選轉(zhuǎn)基因小鼠并建系；研究抑制 CSE 表達(dá)后 ATT/MST 途徑的變化；研究 H2S 與細(xì)胞膜的相互作用。2. 預(yù)期目標(biāo)1）闡明 H2S/HS-在靶分子（PKA /PKG）上的結(jié)合位點(diǎn)， 結(jié)合后靶分子空間構(gòu)象的變化與其功能之間的關(guān)系。2）闡明 Hif-1 是否還存在生存素非依賴的通路。3）得到生物芯片和蛋白差異表達(dá)譜，分離出重要蛋白因子。4) 完成在巰基上引入一系列疏水片段，以加強(qiáng) SPRC 與 CSE 的結(jié)合。并將該一系列化合物應(yīng)在心肌缺血模型上驗(yàn)證心肌的保護(hù)作用，完成 H2S 供體化合物的初篩。5）找到調(diào)控 CSE 表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子；建立轉(zhuǎn)基因小鼠純系；在 mRNA、蛋白 質(zhì)和酶活力水平確定 CSE 被抑制后 ATT/MST 途徑的 變化；建立研究 H2S 與膜作用的研究方法，闡明作用的特性。6）發(fā)表 SCI 論文 6 篇以上，申 請專利 1～2 項。7）培養(yǎng)研究生（博士生，碩士生） 25 名以上。2012 年 1 月至 2012 年 12 月1. 研究內(nèi)容1）H2S/HS-是否可通過調(diào)控 AKAP 所介導(dǎo)的 PKA 錨定作用而間接調(diào)控 PKA 對 α1C亞單位的作用，從而抑制其開放。在心肌細(xì)胞中觀察同位素標(biāo)記的 H2S/HS-是否可直接與 L 型 Ca2+通道結(jié)合（包括 α1C 和 β）。2）觀察 H2S 是否能 夠提高 VEGFR2 的活性。用 AutoDock program 計算 H2S/HS-與 VEGFR2相互作用的位點(diǎn)。3）找到這些重要蛋白因子在大鼠心肌細(xì)胞中的同源蛋白。用酵母雙雜交的方法大規(guī)模篩選重要蛋白在體內(nèi)的相互作用蛋白。同時利用 CHIP-CHIP 和 RIP-CHIP 技術(shù)篩選重要蛋白在體內(nèi)的 DNA 和 RNA 靶點(diǎn)，用免疫共沉淀（CO-IP）和凝膠阻滯（ EMSA）等離子表面共振 SPR和 X-光晶體衍射的方法研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象；4）將分離的重要蛋白因子在裂殖酵母中作轉(zhuǎn)基因和敲除研究，分析其在細(xì)胞周期，增殖和凋亡等方面的表型，并通過提高或降低硫化 氫在細(xì)胞中的濃 度對比野生型細(xì)胞， 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和敲除細(xì)胞的表型。5）采用基因突變技術(shù)改變 SPRC 靶蛋白的分子結(jié)構(gòu)，分析 SPRC 在靶蛋白上的作用位點(diǎn)，揭示 SPRC 結(jié)合與靶位點(diǎn)后 對該靶蛋白功能及對細(xì)胞生理、病理過程的影響。6）通過活體成像技術(shù)，監(jiān)測報 告基因在生理條件下表達(dá)調(diào) 控；研究 CSE 調(diào)控因子的調(diào)控機(jī)制與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；7）利用轉(zhuǎn)基因小鼠建立 I/R 模型；模 擬病理條件下抑制 CSE 表達(dá)后 ATT/MST 途徑的變化；研究外源 H2S 供體在細(xì)胞內(nèi)跨膜遷移輸運(yùn)過程。2. 預(yù)期目標(biāo)1）闡明 H2S/HS-是否可通過調(diào)控 AKAP 所介導(dǎo)的 PKA 錨定作用而間接調(diào)控 PKA 對 α1C亞單位的作用，從而抑制其開放。2）闡明 H2S/HS-是否可直接與 L 型 Ca2+通道結(jié)合。3）闡明 H2S 和 VEGFR2 重組蛋白相互作用的位點(diǎn)。4）揭示硫化氫對蛋白，DNA 和 RNA 的相互作用的影響；5）觀察 SPRC 對這 些酵母菌株作用后所影響到的相關(guān)基因。改變 SPRC 靶蛋白的分子結(jié)構(gòu)，分析 SPRC 在靶蛋白上的作用位點(diǎn)，揭示 SPRC 結(jié)合與靶位點(diǎn)后對該靶蛋白功能及對細(xì)胞生理、病理過程的影響。7）實(shí)驗(yàn) CSE 在心臟中表達(dá)調(diào)控的實(shí)時觀測；闡明 CSE 調(diào)控因子的調(diào)控機(jī)制與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；建立起小鼠 I/R 模型。8）在 mRNA、蛋白質(zhì)和酶活力水平確定病理條件下 CSE 被抑制后 ATT/MST 途徑的變化；闡明外源 H2S 供體在細(xì)胞內(nèi)跨膜能力和特性。9）發(fā)表 SCI 論文 4 篇以上，申 請專利 1～2 項。10）培養(yǎng)研究生（博士生，碩士生） 20 名以上。2013 年 1 月至 2013 年 12 月1. 研究內(nèi)容1）在心肌細(xì)胞中觀察 L 型 Ca2+通道的 α1C 和 β亞單位的相應(yīng)位點(diǎn)是否被激活。在 HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 L 型 Ca2+通道的 α1C 和 β亞單位，研究 H2S/HS-直接調(diào)控 L 型 Ca2+通道的機(jī)制。2）通過核磁共振、質(zhì)譜、紅外光譜掃描、元素分析等實(shí)驗(yàn)方法，結(jié)合計算機(jī)輔助分子動力學(xué)模擬分析，研究 H2S 與 VEGFR2 相互作用后對后者空間構(gòu)象的影響。3）將分離的重要蛋白因子在裂殖酵母/大鼠心肌細(xì)胞中作轉(zhuǎn)基因和敲除研究，分析其在 細(xì)胞周期，增殖和凋亡等方面的表型，并通過提高或降低硫化氫在細(xì)胞中的濃度對比野生型細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和敲除細(xì)胞的表型。4）用酵母雙雜交的方法大規(guī)模篩選重要蛋白在體內(nèi)的相互作用蛋白。同 時利用 CHIP-CHIP和 RIP-CHIP 技術(shù)篩選重要蛋白在體內(nèi)的 DNA 和 RNA 靶點(diǎn)，用免疫共沉淀（CO-IP），凝膠阻滯（EMSA），等離子表面共振 SPR 和 X-光晶體衍射的方法研究蛋白 質(zhì)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象。5）SPRC 衍生物對 缺血、缺氧狀態(tài)下原代培養(yǎng)心室肌細(xì)胞的比較蛋白組學(xué)研究及對缺氧狀態(tài)下游離培養(yǎng)心室組織塊的比較蛋白組學(xué)研究。6）監(jiān)測 I/R 過程中報告基因的表達(dá) 實(shí)時變化；通過生物信息學(xué)、CHIP、DNA 親和層析等方法分離純化病理條件下調(diào)控 CSE 的轉(zhuǎn)錄因子。7）確定 ATT/MST 途徑在生理和病理條件下的 轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控元件；研究 H2S 與細(xì)胞內(nèi)氧化性小分子的相互作用。2. 預(yù)期目標(biāo)1）闡明 H2S/HS-直接調(diào)控 L 型 Ca2+通道的機(jī)制。2）闡明 H2S 與 VEGFR2 相互作用后對后者空間構(gòu)象的影響。3）揭示硫化氫細(xì)胞效應(yīng)中蛋白相互作用機(jī)理及生物學(xué)功能；4）進(jìn)行生物信息學(xué)分析及聚類分析， 篩選出與 H2S 生成相關(guān)蛋白分子。揭示 H2S 生成化合物-炔丙基半胱氨酸對心肌保護(hù) 作用相關(guān)蛋白分子的功能研究。5）建立 I/R 病理模型，實(shí)現(xiàn)對 CSE 表達(dá)調(diào)控的實(shí)時監(jiān)測；找出病理條件下調(diào)控 CSE 的轉(zhuǎn)錄因子；6）找到 ATT/MST 途徑的轉(zhuǎn)錄 因子和調(diào)控元件。 闡明 H2S 與細(xì)胞內(nèi)氧化性小分子的反應(yīng)特性。7）發(fā)表 SCI 論文 5 篇以上，申 請專利 1～2 項。8）培養(yǎng)研究生（博士生，碩士生） 20 名以上。2014 年 1 月至 2014 年 8 月1. 研究內(nèi)容1）研究 H2S/HS-與純化的 α1C 和 β亞單位相互作用后對后者空 間構(gòu)象的影響。2）進(jìn)一步研究 H2S/HS-結(jié)合位點(diǎn)突變的 α1C 和 β亞單位是否 還能與 H2S/HS-發(fā)生相互作用，以此明確 H2S/HS-調(diào)控 α1C 和 β亞單位分子空間構(gòu)象和功能的機(jī)制。3）用免疫共沉淀（CO-IP）、凝膠阻滯（EMSA）、等離子表面共振 SPR 和 X-光晶體衍射的方法研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象。用酵母雙 雜交的方法大規(guī)模篩選 重要蛋白在體內(nèi)的相互作用蛋白。同時利用 CHIP-CHIP 和 RIP-CHIP 技術(shù)篩選重要蛋白在體內(nèi)的 DNA 和 RNA 靶點(diǎn)。 4）將分離的重要蛋白因子在裂殖酵母中作轉(zhuǎn)基因和敲除研究，分析其在細(xì)胞周期，增殖和凋亡等方面的表型，并通過提高或降低硫化 氫在細(xì)胞中的濃度 對比野生型細(xì)胞， 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和敲除細(xì)胞的表型。5）探討 SPRC 衍生物通 過何種機(jī)制起心肌缺血保護(hù)作用； SPRC 衍生物對 CSE 是否具有反饋調(diào)節(jié)作用；揭示 SPRC 衍生物對缺血、缺氧狀態(tài)下原代培養(yǎng)心室肌細(xì)胞的比較蛋白組學(xué)研究。6）SPRC 衍生物在體內(nèi)的代 謝途徑，尚需進(jìn)一步了解其機(jī)制，有待進(jìn)一步進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究。7）研究病理條件下 CSE 調(diào)控因子的調(diào)控機(jī)制與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 測定 I/R 過程中氧自由基和 H2S的變化。8）研究外源 H2S 或 H2S 供體 對心臟的保護(hù)作用；研究 CSE 和 ATT/MST 兩條途徑的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和協(xié)調(diào)機(jī)制；研究 H2S 與細(xì)胞內(nèi)金屬離子的相互作用。2. 預(yù)期目標(biāo)1）闡明 H2S/HS-與純化的 α1C 和 β亞單位相互作用后對后者空 間構(gòu)象的影響。2）結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué), 生物化學(xué)和分子生物學(xué)以及細(xì)胞生物學(xué)的結(jié)果繪制一幅完整的信號通路的圖，揭示硫化 氫細(xì)胞效應(yīng)的分子機(jī)制；3）闡明 SPRC 衍生物 對心肌缺血時線粒體 KATP、KCa 和 PTP 離子通道的影響及其抗氧化作用關(guān)鍵蛋白 SOD 和 CAT 影響，闡明 SPRC 衍生物在體內(nèi)的代謝途徑，找出其代謝過程中的關(guān)鍵酶。4）揭示 SPRC 衍生物在體內(nèi) 釋放 H2S 的過程及其代謝規(guī)律。5）闡明病理條件下 CSE 調(diào)控因子的調(diào)控機(jī)制與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)； 闡明 I/R 過程中心臟里氧自由基和 H2S 的變化 規(guī)律；闡明 CSE 和 ATT/MST 兩條途徑的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和協(xié)調(diào)機(jī)制；闡明 H2S 與細(xì)胞內(nèi)金屬離子反應(yīng)的特性。6）發(fā)表 SCI 論文 5 篇以上。7）培養(yǎng)研究生（博士生，碩士生） 15 名以上。8）完成結(jié)題。