食品微生物課件 第五章_沙門氏菌的檢驗(yàn)

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1、第 五 章 沙 門 氏 菌 的 檢 驗(yàn) 本 章 重 點(diǎn) 掌 握 ：1、 食 品 中 沙 門 氏 菌 的 檢 驗(yàn) 原 理2、 食 品 中 沙 門 氏 菌 的 檢 驗(yàn) 方 法 一 、 沙 門 氏 菌 屬 簡(jiǎn) 介DANIEL ELMER SALMON, (1850-1914)美 國(guó) 獸 醫(yī) 微 生 物 和 病 理 學(xué) 家 。 是 美 國(guó) 授 予的 第 一 位 獸 醫(yī) 學(xué) 博 士 。 1884年 任 美 國(guó) 農(nóng) 業(yè)部 畜 牧 局 首 任 局 長(zhǎng) 。 他 首 次 從 病 豬 中 分 離出 豬 霍 亂 沙 門 氏 菌 。 在 醫(yī) 學(xué) 微 生 物 中 通 用的 沙 門 菌 一 詞 ， 就 是 為 紀(jì) 念 他

2、 而 以 他 的 名字 命 名 的 。 沙 門 氏 菌 分 為 三 大 類 群n 第 一 類 群 ： 專 門 對(duì) 人 致 病n 第 二 類 群 ： 食 物 中 毒 沙 門 氏 菌 群n 第 三 類 群 ： 專 門 對(duì) 動(dòng) 物 致 病 事 例n 俄 亥 俄 州 國(guó) 王 堅(jiān) 果 公 司 生 產(chǎn) 的 磅 （ 2.27千 克 ） 重 罐裝 花 生 醬 中 含 有 沙 門 氏 菌 。 國(guó) 王 堅(jiān) 果 公 司 日 發(fā) 表聲 明 說 ， 接 到 明 尼 蘇 達(dá) 州 方 面 的 通 報(bào) 后 ， 公 司 立 即 決定 全 部 召 回 公 司 及 其 下 屬 兩 家 公 司 生 產(chǎn) 的 花 生 醬 。 美 國(guó) 疾

3、 病 控 制 和 預(yù) 防 中 心 日 發(fā) 表 的 新 聞 公 報(bào) 又 將國(guó) 王 堅(jiān) 果 公 司 推 向 風(fēng) 口 浪 尖 。 公 報(bào) 說 ， 自 去 年 月 以來 ， 美 國(guó) 共 有 個(gè) 州 發(fā) 現(xiàn) 沙 門 氏 菌 疫 情 ， 染 病 人 數(shù) 達(dá) 到 人 ， 并 有 人 被 懷 疑 在 感 染 沙 門 氏 菌 后 死 亡 。 調(diào) 查 發(fā) 現(xiàn) ， 幾 乎 所 有 感 染 沙 門 氏 菌 的 患 者 都 食 用 過 花 生 醬 ， 并 且 大 多 數(shù) 人 食 用 的 都 是 國(guó) 王 堅(jiān) 果 公 司 的 磅 重 罐 裝 花 生 醬 。 n 人 民 網(wǎng) 12月 7日 電 美 國(guó) 牛 肉 包 裝 公 司

4、日 前 宣 布 ， 將 從 亞 利 桑 那 州和 新 墨 西 哥 州 的 多 家 超 市 召 回 大 約 10噸 牛 肉 餡 。 據(jù) 悉 ， 這 些 牛 肉餡 遭 一 種 有 抗 藥 性 的 沙 門 氏 菌 污 染 ， 目 前 已 經(jīng) 造 成 多 人 因 食 用 這批 牛 肉 而 生 病 。 這 是 該 公 司 今 年 在 美 國(guó) 境 內(nèi) 第 二 次 發(fā) 出 召 回 牛 肉餡 的 通 知 。 今 年 8月 ， 這 家 牛 肉 公 司 也 曾 召 回 了 將 近 400噸 牛 肉 餡 。 當(dāng) 時(shí) ，那 批 產(chǎn) 品 造 成 至 少 39人 生 病 。 對(duì) 免 疫 系 統(tǒng) 虛 弱 的 老 年 人 和

5、 幼 兒 來說 ， 這 些 被 沙 門 氏 菌 污 染 的 牛 肉 餡 可 能 帶 來 致 命 后 果 ， 其 癥 狀 包括 腹 瀉 、 高 燒 、 肚 子 疼 和 嘔 吐 。 由 于 這 種 沙 門 氏 菌 具 有 強(qiáng) 抗 藥 性 ， 因 此 更 加 危 險(xiǎn) 。 生 物 學(xué) 特 性 形 態(tài) 染 色 特 征 ： 革 蘭 氏 陰 性 ， 大 小 為 1-3 0.4-0.9 m的 兩 端 鈍圓 的 短 桿 菌 ， 無 芽 孢 ， 一般 無 莢 膜 ， 除 雞 白 痢 沙 門氏 菌 和 雞 傷 寒 沙 門 氏 菌 以外 ， 都 有 周 身 鞭 毛 ， 運(yùn) 動(dòng)力 強(qiáng) ， 具 菌 毛 。 培 養(yǎng) 特 性

6、 ：n 沙 門 氏 菌 需 氧 或 兼 性 ， 10 42 都 可 生 長(zhǎng) ， 最 適 生 長(zhǎng) 溫度 為 37 ， 最 適 pH 為 6.8 7.8。n 營(yíng) 養(yǎng) 瓊 脂 平 板 上 ： 35 37 培 養(yǎng)18 24h， 其 菌 落 大 小 一 般 為 23mm， 光 滑 、 濕 潤(rùn) 、 無 色 、 半 透明 、 邊 緣 整 齊 。 n 血 平 板 ： 中 等 大 小 、 灰 白 色 菌 落 。生 物 學(xué) 特 性 生 物 學(xué) 特 性生 化 反 應(yīng) ：不 發(fā) 酵 乳 糖 和 蔗 糖 ， 不 產(chǎn) 生吲 哚 ， 不 分 解 尿 素 ， VP試 驗(yàn)陰 性 ， 大 多 產(chǎn) 生 硫 化 氫 。 發(fā)酵 葡 萄

7、 糖 、 麥 芽 糖 和 甘 露 醇 ，除 傷 寒 桿 菌 產(chǎn) 酸 不 產(chǎn) 氣 外 ，其 他 沙 門 氏 菌 均 產(chǎn) 酸 產(chǎn) 氣 。 抵 抗 力n 不 耐 熱 ， 55 1h或 者 60 15-30min即 可 殺 死n 普 通 水 中 可 生 存 2-3周 ， 糞 便 中 存 活 1-2月n 在 牛 乳 和 肉 類 ， 存 活 數(shù) 月 ， 腌 肉 中 存 活 2-3月n 冷 凍 對(duì) 沙 門 氏 菌 無 殺 滅 作 用 ， 即 使 在 -25 低溫 仍 可 存 活 10個(gè) 月 左 右 沙 門 氏 菌 的 來 源n 家 畜 、 家 禽 的 生 前 感 染 和 宰 后 污 染n 乳 中 沙 門 氏

8、 菌 的 來 源n 蛋 類 沙 門 氏 菌 的 來 源n 熟 制 品 中 沙 門 氏 菌 的 來 源 沙 門 氏 菌 屬 流 行 病 學(xué) 特 點(diǎn)n 季 節(jié) 性 特 點(diǎn) 全 年 皆 可 發(fā) 生 ， 多 見 于 夏 、秋 兩 季 ， 主 要 癥 狀 急 性 腸 胃 炎n 食 品 種 類 沙 門 氏 菌 食 物 中 毒 的 食 品 主 要為 動(dòng) 物 性 食 品 ， 特 別 是 畜 肉 類 及 其 制 品n 沙 門 氏 菌 污 染 肉 類 食 物 的 幾 率 很 高 發(fā) 病 率 及 影 響 因 素n 沙 門 氏 菌 食 物 中 毒 發(fā) 病 率 較 高 ， 占 總 食 物 中毒 的 40 60 ， 最

9、高 可 達(dá) 90n 沙 門 氏 菌 致 病 力 強(qiáng) 弱 與 菌 型 有 關(guān)n 沙 門 氏 菌 致 病 力 強(qiáng) 弱 與 易 感 人 群 有 關(guān) 二 、 檢 驗(yàn) 選 擇 性 平 板 分 離選 擇 性 增 菌前 增 菌生 化 鑒 定血 清 學(xué) 鑒 定 檢 樣25g樣 品 225mLBPW36 1 8h 18h1mL TTB10mL 1mL SC10mLBS H E（ 或 XLD、 SS）TSI（ 排 除 A/A H 2S 結(jié) 果 ） ， 賴 氨 酸 ， 靛 基 質(zhì) ， 尿 素 ， KCN 沙 門 氏 菌 血 清 學(xué) 試 驗(yàn) 甘 露 醇 山 梨 醇 H 2S 靛 尿 KCN 賴 H 2S 靛 尿 KC

10、N 賴 / 非 如 左 述 的 各 種 反 應(yīng) 結(jié) 果沙 門 氏 菌 血 清 學(xué) 試 驗(yàn) ONPG 沙 門 氏 菌 血 清 學(xué) 試 驗(yàn) 非 沙 門 氏 菌36 1 18h 24h 36 1 18h 24h36 1 40h 48h 36 1 18h 24h 中 華 人 民 共 和 國(guó)國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn) GB/T 4789.4-2010H 2S 靛 尿 KCN 賴 報(bào) 告 沙 門 氏 菌 在 BS平 板 上 沙 門 氏 菌 在 H E平 板 上 沙 門 氏 菌 的 TSI試 驗(yàn) 三 糖 鐵 （ TSI） 瓊 脂 試 驗(yàn)本 試 驗(yàn) 可 同 時(shí) 觀 察 乳 糖 和 蔗 糖 發(fā) 酵 產(chǎn) 酸 或 產(chǎn) 酸 產(chǎn)

11、氣 （ 變 黃 ） ； 產(chǎn) 生 硫 化 氫（ 變 黑 ） 。 葡 萄 糖 被 分 解 產(chǎn) 酸 可 使 斜 面 先 變 黃 ， 但 因 量 少 ， 生 成 的 少 量 酸， 因 接 觸 空 氣 而 氧 化 ， 加 之 細(xì) 菌 利 用 培 養(yǎng) 基 中 含 氮 物 質(zhì) ， 生 成 堿 性 產(chǎn) 物 ，故 使 斜 面 后 來 又 變 紅 ， 底 部 由 于 是 在 厭 氧 狀 態(tài) 下 ， 酸 類 不 被 氧 化 ， 所 以 仍保 持 黃 色 。 a. uninoculated b. little change/alkaline/-/- c. alkaline/acid/-/+ d. acid/acid/

12、+/+ e. acid/acid/+/- slant color/butt color/gas production/hydrogen sulfide production 賴 氨 酸 脫 羧 酶 試 驗(yàn)試驗(yàn)管 對(duì)照管陽 性 + 陰 性 - 對(duì)照管變黃試驗(yàn)管變黃 靛 基 質(zhì) （ Imdole） 試 驗(yàn)?zāi)?些 細(xì) 菌 能 分 解 蛋 白 胨 中 的 色 氨 酸 ， 生 成 吲 哚 。 吲 哚 的 存 在 可 用 顯 色 反應(yīng) 表 現(xiàn) 出 來 。 吲 哚 與 對(duì) 二 甲 基 氨 基 苯 醛 結(jié) 合 ， 形 成 玫 瑰 吲 哚 ， 為 紅 色 化合 物 。 尿 素 酶 （ Urease） 試 驗(yàn)有

13、些 細(xì) 菌 能 產(chǎn) 生 尿 素 酶 ， 將 尿 素 分 解 、 產(chǎn) 生 2個(gè) 分 子 的 氨 ，使 培 養(yǎng) 基 變 為 堿 性 ， 酚 紅 呈 粉 紅 色 。1、 未 接 種2、 尿 素 酶 陽 性3、 尿 素 酶 陰 性 KCN生 長(zhǎng) 試 驗(yàn)右 ： 抑 制 生 長(zhǎng) 斜 面 底 層 產(chǎn) 氣 硫 化 氫 初 步 判 斷 K A ( ) ( )K A ( ) ( )A A ( ) ( )沙 門 氏 菌 在 TSI和 賴 氨 酸 脫 羧 酶 試 驗(yàn) 培 養(yǎng) 基 內(nèi) 的 結(jié) 果賴 氨 酸 脫 羧 酶 可 疑 沙 門 氏 菌 屬可 疑 沙 門 氏 菌 屬可 疑 沙 門 氏 菌 屬A A / / 非 沙

14、門 氏 菌 屬K K / / +/ 非 沙 門 氏 菌 屬K:產(chǎn) 堿 ； A： 產(chǎn) 酸 ； +（ -） ： 多 數(shù) 陽 性 ， 少 數(shù) 陰 性 ； +/-： 陽 性 或 者 陰 性 腸 桿 菌 科 各 屬 生 化 反 應(yīng) 初 步 鑒 別 表 序號(hào) 硫 化 氫 靛 基 質(zhì) 尿 素 氰 化 鉀 賴 氨 酸脫 羧 酶 判 定 菌 屬 A1 + + 沙 門 氏 菌 屬 A2 + + + A3 +/ A1： 沙 門 氏 菌 屬 ； 如 尿 素 、 氰 化 鉀 、 賴 氨 酸 脫 羧 酶 有 一 項(xiàng) 異 常 ； 兩 項(xiàng) 異 常 ： 非 腸 桿 菌 科 各 屬 生 化 反 應(yīng) 初 步 鑒 別 表pH7.2尿

15、 素 氰 化 鉀（ KCN） 賴 氨 酸 脫 羧 酶 判 定 結(jié) 果 甲 型 副 傷 寒 沙 門 氏 菌 （ 要 求 血 清學(xué) 鑒 定 結(jié) 果 ）沙 門 氏 菌 或 （ 要 求 符 合 本 群生 化 特 性 ）沙 門 氏 菌 個(gè) 別 變 體 （ 要 求 血 清 學(xué)鑒 定 結(jié) 果 ） 反 應(yīng) 序 號(hào) A2： 補(bǔ) 做 甘 露 醇 和 山 梨 醇 試 驗(yàn)甘 露 醇 山 梨 醇 判 定 結(jié) 果 + + 沙 門 氏 菌 靛 基 質(zhì) 陽 性 變 體 （ 要 求 血 清 學(xué) 鑒 定 結(jié) 果 ） 非 沙 門 菌 反 應(yīng) 序 號(hào) A3： 補(bǔ) 做 ONPGn ONPG+為 大 腸 埃 希 氏菌 ， ONPG為 沙

16、 門 氏菌 。 同 時(shí) ， 沙 門 氏 菌應(yīng) 為 賴 氨 酸 +， 但 甲 型副 傷 寒 沙 門 氏 菌 為 賴氨 酸 -。n ONPG: 鄰 硝 基 酚 D 半 乳 糖 苷 ONPG試 驗(yàn)陽 性 （ 黃 ） 空 白 血 清 學(xué) 鑒 定 鞭 毛 抗 原 （ H）菌 體 抗 原 （ O）K或 Vi抗 原 血 清 學(xué) 鑒 定 n 一 般 采 用 1.5%瓊 脂 斜 面培 養(yǎng) 物 作 為 玻 片 凝 集 試 驗(yàn)用 的 抗 原 。n 用 A F多 價(jià) O血 清 做 玻 片凝 集 試 驗(yàn) ， 同 時(shí) 用 生 理 鹽水 做 對(duì) 照 。 在 生 理 鹽 水 中自 凝 者 為 粗 糙 形 菌 株 ， 不能 分

17、 型 。 沙 門 氏 菌 檢 驗(yàn) 幾 點(diǎn) 注 意n 冷 凍 樣 品 解 凍 需 在 45 以 下 ， 有 自 動(dòng) 調(diào) 溫 器 自 控 的 水 浴 鍋 內(nèi) 不 斷 攪 拌進(jìn) 行 15min或 在 2-8 ， 18小 時(shí) 內(nèi) 軟 化 。q 為 保 證 檢 驗(yàn) 的 準(zhǔn) 確 性 ， 必 須 在 選 擇 性 培 養(yǎng) 基 上 挑 取 足夠 數(shù) 量 的 菌 落 進(jìn) 行 生 化 和 血 清 學(xué) 鑒 定 。n 進(jìn) 行 生 化 反 應(yīng) 時(shí) ， 應(yīng) 以 純 培 養(yǎng) 物 進(jìn) 行 試 驗(yàn) ， 如 出 現(xiàn) 血 清 學(xué) 陽 性 ， 而 生化 反 應(yīng) 特 征 不 符 合 時(shí) ， 應(yīng) 對(duì) 接 種 物 進(jìn) 行 純 化 ， 用 純

18、 化 后 的 培 養(yǎng) 物 重 新進(jìn) 行 生 化 試 驗(yàn) 。 q 測(cè) 試 中 應(yīng) 同 時(shí) 接 種 陽 性 對(duì) 照 菌 株 。 沙 門 菌 儀 器 檢 測(cè) 法n VIDAS（ 生 物 梅 里 埃 公 司 ） n BAX （ 杜 邦 公 司 ） 沙 門 菌 儀 器 檢 測(cè) 法n VIDAS 應(yīng) 用 酶 聯(lián) 免 疫 技 術(shù) 制 造 的 全 自 動(dòng) 免 疫 分 析 儀 ， 用熒 光 分 析 技 術(shù) 通 過 固 相 吸 附 器 ， 用 已 知 抗 體 來 捕 捉 目標(biāo) 生 物 體 ， 然 后 以 帶 熒 光 的 酶 聯(lián) 抗 體 再 次 結(jié) 合 ， 經(jīng) 充分 沖 洗 ， 通 過 激 發(fā) 光 源 檢 測(cè) ，

19、即 能 自 動(dòng) 讀 出 發(fā) 光 的 陽性 標(biāo) 本 ， 其 優(yōu) 點(diǎn) 是 檢 測(cè) 靈 敏 度 高 ， 速 度 快 ， 可 以 在 48小 時(shí) 的 時(shí) 間 內(nèi) 快 速 鑒 定 沙 門 氏 菌 、 大 腸 桿 菌 O157：H7、 單 核 李 斯 特 菌 ， 空 腸 彎 曲 桿 菌 和 葡 萄 球 菌 腸 毒 素等 。 沙 門 菌 儀 器 檢 測(cè) 法n DUPONT Qualicon BAX System 應(yīng) 用 DNA分 子 核 酸 探 針 或 基 因 探 針 技 術(shù) 制 造 的全 自 動(dòng) PCR分 析 儀 。 將 已 知 核 苷 酸 序 列 DNA片 段 用同 位 素 或 其 他 方 法 標(biāo) 記

20、， 加 入 已 變 性 的 被 檢 DNA樣品 中 ， 在 一 定 條 件 下 即 可 與 該 樣 品 中 有 同 源 序 列 的 DNA區(qū) 段 形 成 雜 交 雙 鏈 ， 從 而 達(dá) 到 鑒 定 樣 品 中 DNA 的 目 的 。 商 品 化 生 化 鑒 定 系 統(tǒng)VITEK GNI+ 應(yīng) 用 一 系 列 小 的 多 孔 的 聚 苯乙 烯 卡 片 進(jìn) 行 測(cè) 試 ， 卡 片 含 有干 燥 的 抗 菌 藥 物 和 生 化 基 質(zhì) 。先 制 備 一 定 濃 度 的 欲 鑒 定 菌 株的 菌 懸 液 ， 然 后 將 菌 懸 液 接 種到 各 種 細(xì) 菌 的 小 卡 上 ， 將 其 放入 具 有 讀

21、 數(shù) 功 能 的 孵 箱 內(nèi) ， 每隔 一 定 時(shí) 間 ， 儀 器 會(huì) 自 動(dòng) 檢 測(cè)培 養(yǎng) 基 的 發(fā) 酵 情 況 ， 并 換 算 成能 被 計(jì) 算 機(jī) 所 接 受 的 生 物 編 碼 。最 后 由 計(jì) 算 機(jī) 判 定 ， 打 印 出 鑒定 結(jié) 果 。 商 品 化 生 化 鑒 定 系 統(tǒng)n API 20E API 20E 生 化 鑒 定 是 根 據(jù) 快 速 酶 促 反 應(yīng) 及 代 謝 產(chǎn) 物 的 檢 測(cè) 技 術(shù) 發(fā) 展 的 一 種 細(xì) 菌 編 碼 鑒 定 法 ， 廣 泛 應(yīng) 用 于 臨 床 、 食 品 中 革 蘭 氏 陰 性 桿 菌 的 快 速 鑒 定 。 API 20E第 1位 數(shù) 第 2

22、位 數(shù) 第 3位 數(shù) 第 4位 數(shù) 第 5位 數(shù) 第 6位 數(shù) 第 7位 數(shù) 結(jié)果判定ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RGA SAC MEL AMY ARA OX1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 1 2 4 反 應(yīng)結(jié) 果 - + + + + + - - - - - + + + + + - + - + - 沙門菌應(yīng) 得樹 枝 0 2 4 1 2 4 0 0 0 0 0 4 1 2 4 1 0 4 0 2 0組 合編 碼 6 7 0 4 7 5 2 沙 門 氏 菌 在 CHROMagar顯 色 培 養(yǎng) 基 上 的 菌 落 特 （ 紫 ）沙 門 氏 菌 在 海 博 公 司 顯 色 培養(yǎng) 基 上 的 菌 落 特 征 （ 紅 ）沙 門 菌 檢 測(cè) 顯 色 培 養(yǎng) 基