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1、單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,*,染色體標(biāo)本制備及核型分析,染色體核型分析,質(zhì)量保障部,Faye,一、名詞解釋,二、染色體標(biāo)本制備,三、染色體核型分析,實驗耗材,前期處理,實驗步驟,玻片標(biāo)本質(zhì)量評價,計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)、合格指標(biāo),染色體核型排列,核型檢測的可重復(fù)性,一、名詞解釋,核型,分裂相,一個體細(xì)胞中的全部染色體，按其大小、形態(tài)特征順序排列所構(gòu)成的圖像。,小鼠：,40,，,XY,、,40,，,XX,人類：,46,，,XY,、,46,，,XX,細(xì)胞分裂過程中每個時期的細(xì)胞形態(tài)特征，包括細(xì)胞的總體形狀和遺傳物質(zhì)的變化。,一、名詞解釋,數(shù)量,變異,
2、（性染色體丟失,/,增加、近端著絲粒染色體三體）,（中期）分裂相,核型,結(jié)構(gòu),變異,（缺失、重復(fù)、倒位、易位）,二、染色體標(biāo)本制備,實驗耗材,儀器設(shè)備：,超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、離心機、光學(xué)顯微鏡、刻度離心管、乳頭吸管、棕色試劑瓶、載玻片、吹風(fēng)機、玻片架、染色缸,主要試劑：,秋水仙素、低滲液、卡諾氏固定液、吉姆薩染液、胰酶、,1N HCl,、,1N NaOH,、,MEF,培養(yǎng)基、,PBS,二、染色體標(biāo)本制備,前期處理,樣品要求：對數(shù)期生長，狀態(tài)良好，緊密度高，折光性好，細(xì)胞量,T25/60 mm,平皿,差速貼壁法去除,MEF,（,KSR,培養(yǎng)體系除外）,終止,培養(yǎng),前,12,小時，
3、,加入,秋水仙素,（,100ug/ml,）,，最終濃度為,0.10.2ug/ml,。,作用：破壞紡錘體,防護：有劇毒、無揮發(fā)性,因素：時間、濃度,二、染色體標(biāo)本制備,固定,細(xì)胞收獲,制片,預(yù)固定,低滲處理,實驗步驟,二、染色體標(biāo)本制備,細(xì)胞收獲,制片,固定,預(yù)固定,低滲處理,消化并收集細(xì)胞至離心管,，吹打成,單細(xì)胞懸液,，,250 g,，,5 min,離心，棄上清,實驗步驟,二、染色體標(biāo)本制備,細(xì)胞收獲,制片,固定,預(yù)固定,低滲處理,加入,37,預(yù)熱的,低滲液（,0.075 mol/L,）,5 ml,，吹打至均勻，,37,水浴,15-20 min,。,實驗步驟,二、染色體標(biāo)本制備,細(xì)胞收獲,制
4、片,固定,預(yù)固定,低滲處理,加入,37,預(yù)熱的,低滲液,（,0.075 mol/L,）,5 ml,，吹打至均勻，,37,水浴,15-20 min,。,實驗步驟,配制,：,0.075 mol/L KC,l,溶液,作用：低滲作用,因素：時間、溫度、濃度,二、染色體標(biāo)本制備,細(xì)胞收獲,制片,固定,預(yù)固定,低滲處理,實驗步驟,離心棄上清，將細(xì)胞沉淀震蕩懸浮或,氣泡吹打法,輕柔地重懸細(xì)胞。沿管壁緩慢加入,固定液,0.5-1.0 mL,，,邊滴加邊震蕩,均勻，靜置,5 min,后離心棄上清。,二、染色體標(biāo)本制備,細(xì)胞收獲,制片,固定,預(yù)固定,低滲處理,實驗步驟,離心棄上清，將細(xì)胞沉淀震蕩懸浮或,氣泡吹打法
5、,輕柔地重懸細(xì)胞。沿管壁緩慢加入,固定液,0.5-1.0 mL,，,邊滴加邊震蕩,均勻，靜置,5 min,后離心棄上清。,配制：甲醇：冰乙酸,=3,：,1,，,現(xiàn)用現(xiàn)配,。,作用：固定并維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性,防護：甲醇毒性，,冰乙酸刺激性和腐蝕性,二、染色體標(biāo)本制備,細(xì)胞收獲,制片,固定,預(yù)固定,低滲處理,實驗步驟,（,1,）加入,3ml,固定液,，靜置,30min,，離心棄上清；,（,2,）再次加入,3ml,固定液,，吹打均勻并靜置,30min,二、染色體標(biāo)本制備,細(xì)胞收獲,制片,固定,預(yù)固定,低滲處理,實驗步驟,離心棄上清液，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量情況，加入,12 mL,固定液，吹打細(xì)胞制成懸液，
6、懸液呈微白色時為最佳,。,二、染色體標(biāo)本制備,細(xì)胞收獲,制片,固定,預(yù)固定,低滲處理,實驗內(nèi)容,用滴管吸,取,細(xì)胞懸液，,高空,滴在,冰凍玻片,上，,立即在酒精燈的火焰下過火幾次,，,置,80,烤箱中烤片,2h,。,二、染色體標(biāo)本制備,細(xì)胞收獲,制片,固定,預(yù)固定,低滲處理,實驗步驟,用滴管吸,取,細(xì)胞懸液，,高空,滴在,冰凍玻片,上，,立即在酒精燈的火焰下過火幾次,，,置,80,烤箱中烤片,2h,。,要求：潔凈、冰凍,處理：逐片清洗（洗潔精超聲波自來水純水），,95%,乙醇浸泡,24 h,，純水逐片刷洗，放置于裝有純水的器皿中，,4,保存。,二、染色體標(biāo)本制備,細(xì)胞收獲,制片,固定,預(yù)固定,
7、低滲處理,實驗步驟,預(yù)熱,胰蛋白酶,消化,25-30s,，,Giemsa,染色,10min,。,清水沖洗染液，用吹風(fēng)機吹干。,二、染色體標(biāo)本制備,細(xì)胞收獲,制片,固定,預(yù)固定,低滲處理,實驗步驟,預(yù)熱,胰蛋白酶,消化,25-30s,，,Giemsa,染色,10min,。,清水沖洗染液，用吹風(fēng)機吹干。,要求：,0.25%,，,p,H6.8,7.2,作用：,去除染色體上的蛋白質(zhì)，便于染色。,配制：,Giemsa,原液：磷酸緩沖液（,pH 7.4,）,=1,：,9,，,現(xiàn)用現(xiàn)配,。,三、染色體核型分析,玻片標(biāo)本質(zhì)量評價,玻片顏色,藍紫色 玫紅色 著色淺,解決方案,配制新的染液；,適當(dāng)提高胰酶消化玻片
8、的時間。,三、染色體核型分析,玻片標(biāo)本質(zhì)量評價,細(xì)胞密度,過密 適中 過稀,解決方案,制備玻片時，對每一個樣品都先進行試片，并在鏡下觀察細(xì)胞密度，從而調(diào)整懸液密度。,三、染色體核型分析,玻片標(biāo)本質(zhì)量評價,分裂相密度,足夠 稀少,解決方案,適當(dāng)提高固定液中冰醋酸比例；制備較多的玻片,三、染色體核型分析,玻片標(biāo)本質(zhì)量評價,分裂相形態(tài),-,緊密度,過密 適中 過散,解決方案,過密：適當(dāng)提高固定液中冰醋酸比例；,過散：適當(dāng)降低固定液中冰醋酸比例。,三、染色體核型分析,玻片標(biāo)本質(zhì)量評價,分裂相形態(tài),過密 適中 過散,解決方案,過密：適當(dāng)提高固定液中冰醋酸比例，增加滴片高度；,過散：適當(dāng)降低固定液中冰醋酸
9、比例，減小滴片高度。,三、染色體核型分析,玻片標(biāo)本質(zhì)量評價,分裂相形態(tài),解決方案,盡量將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液；,滴片時勿重復(fù)滴加同一區(qū)域。,重疊,三、染色體核型分析,玻片標(biāo)本質(zhì)量評價,染色體形態(tài),適中 短小 過長 扭曲交聯(lián) 消化過度,三、染色體核型分析,計數(shù)標(biāo)準(zhǔn),合格指標(biāo),分裂相需完整獨立，染色體不過于松散，周圍無其他距離很近的分裂相。,染色體形態(tài)適中，不過度短小或纖長，染色體彼此間無交聯(lián)纏繞或者交聯(lián)的染色體能明確的區(qū)分。,染色體,G,顯帶普遍較清晰，質(zhì)檢人員能夠精確的判斷核型位置。,計數(shù),30,個分裂相，正常比例,50%,數(shù)量是否異常,暫不涉及核型排列 結(jié)構(gòu)是否異常,三、染色體核型分析,染色體核型排列,三、染色體核型分析,染色體核型排列,三、染色體核型分析,染色體核型排列,三、染色體核型分析,染色體核型排列,正常：,46,，,XY,大,Y,：,46,，,XY,，,Y,18,小,Y,：,46,，,XY,，,Y,G,組,三、染色體核型分析,核型檢測的可重復(fù)性,染色體標(biāo)本制備及核型分析,
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